丹參多酚酸對2型糖尿病腎病大鼠腎小管間質激活素A表達的影響研究

王玲 吳秋楓

丹參多酚酸對2型糖尿病腎病大鼠腎小管間質激活素A表達的影響研究

王玲 吳秋楓

目的采用高脂飲食加鏈脲佐菌素誘導2型糖尿病大鼠模型，觀察丹參多酚酸對其腎臟是否有保護作用及其保護機理。方法選取清潔級雄性SD大鼠50只，適應性喂養10天后隨機分為正常組、糖尿病腎病組(模型組)以及丹參多酚酸低、中和高劑量治療組，每組10只，模型建立成功后，正常組和模型組給予生理鹽水0.1 mL/(kg·d)注射，丹參多酚酸低、中和高劑量分別給予丹參多酚酸10 mL/(kg·d)、20 mL/(kg·d)和40 mL/(kg·d)注射，8周后處死大鼠，檢測血糖、胰島素、24小時尿蛋白，同時HE染色觀察肝臟病理學，免疫組化、Western blot和RT-PCR檢測腎臟組織中腎小管間質激活素A(activin A，Act-A)的表達特點。結果與正常組相比，模型組血糖明顯升高(P<0.05)，胰島素明顯降低(P<0.05)，丹參多酚酸治療后，與模型組相比，高劑量組血糖明顯降低(P<0.05)，胰島素含量明顯升高(P<0.05)，而中劑量組和低劑量組并沒有差異；與正常組相比，模型組腎臟肥大指數、24小時尿蛋白以及Scr明顯升高(P<0.05)，丹參多酚酸治療后，含量均較模型組明顯降低(P<0.05)；腎臟組織病理學可見，丹參多酚酸三個治療組相較于模型組，炎癥反應和腎間系膜增生明顯減輕；此外，與正常組相比，免疫組化、Western blot以及RT-PCR可見模型組Act-A明顯升高(P<0.05)，采用高劑量治療后其表達明顯降低(P<0.05)，隨著給藥劑量的增加，呈明顯劑量依賴性。結論丹參多酚酸雖對降低2型糖尿病大鼠血糖以及提升胰島素含量幾乎沒有作用，但其可明顯改善腎臟24小時尿蛋白排泄，同時有效改善腎小管間質損傷，這可能與其可降低Act-A表達，進而延緩腎臟發生纖維化相關。

丹參多酚酸； 2型糖尿??； 腎??； 激活素A

近年來，隨著人們生活水平的提高，過量碳水化物攝入增加，2型糖尿病的發生率也急劇增加[1]。2型糖尿病發生率增高，進而可引起糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)發病率增加[2]。最新的一份調查研究顯示[3]，在世界范圍內DN的發生率均呈高發的態勢，以歐美國家為例，其發病率極高，占糖尿病人數的25%～42%，而中國目前還較低，為6%～10%。DN危害極大，其不僅表現有腎臟微血管的病變，同時也是導致腎小球硬化的危險因素，而腎小球硬化是糖尿病最為嚴重的并發癥之一，也是引起患者死亡的主要死因[4]。丹參多酚酸注射液是目前臨床中常用的一種穩定性心絞痛藥物，其具有活血、化瘀、通脈的作用[5]，而課題組在臨床研究統計中發現，糖尿病心臟損害的患者在給予注射丹參多酚酸后，其腎功能明顯改善。因此通過建立2型糖尿病大鼠模型，給予8周丹參多酚酸治療，以觀察其對DN是否有治療作用，及其作用的機制，為丹參多酚酸的開發和糖尿病腎病的治療提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1對象

選用SPF級雄性SD大鼠[湖北中醫藥高等?？茖W校實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(鄂)2014-0017]，大鼠6周齡，體重180～220 g。大鼠購買后立即置于標準飼養間，適應性喂養期間由其自由飲水和飲食，控制明暗周期為12小時，溫度保持在18～26℃之間，相對濕度控制65%～75%。

1.2實驗材料與試劑

1.2.1 實驗主要藥品 鏈脲佐菌素(STZ)購于美國Sigma公司；丹參多酚酸購于天津天士力之驕藥業有限公司。

1.2.2 實驗主要試劑 水合氯醛購于上海生化試劑公司；Scr試劑盒、血糖測定試劑盒、胰島素測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所；檸檬酸鈉緩沖液自行配制；0.9%氯化鈉注射液購于廣西裕源藥業有限公司；Act-A抗體、ECL發光試劑盒購于美國Santa公司，膠卷購于柯達公司，引物由上海英俊公司設計并生產。其他常規試劑由武漢科技大學附屬天佑醫院生化實驗室病理科提供。

1.3糖尿病大鼠模型的分組、制備與治療

所有大鼠在適應性喂養10天后隨機分為正常組、模型組以及丹參多酚酸低、中和高劑量治療組。除正常組給予普通飼料外，其余4組給予高脂飲水1個月，1個月后正常組給予一次性腹腔注射用檸檬酸緩沖液，其余4組給予55 mg/kg STZ溶液,一次性腹腔注射造模。72小時后，檢測其血糖水平，當連續7天血糖值大于等于15.6 mmol/L時確定造模成功。造模成功后，正常組和模型組給予生理鹽水0.1 mL/(kg·d)大鼠體重注射，丹參多酚酸低、中和高劑量組分別給予丹參多酚酸5 mL/(kg·d)、10 mL/(kg·d)和20 mL/(kg·d)注射治療。

1.4標本采集

1.4.1 實驗大鼠尿液標本留取 分別于造模前、治療4周后以及治療8周后早上8點將大鼠置于金屬代謝籠中，收集24小時尿量蛋白，并記錄，尿液收集后將其統一保存于超低溫冰箱中保存(-78℃)，以備統一檢測定量。

1.4.2 實驗大鼠血液標本留取 于實驗第8周后處死大鼠，處死前先稱重，之后給予2%的水合氯醛腹腔注射麻醉(5 mL/kg)，麻醉后將其固定于解剖板，之后迅速打開胸腔，找到腹主動脈，用無菌注射器斜插進腹主動脈后取血，血液收集后置于1.5 mL離心管中離心，離心后收集血清，備用于檢測相關指標。

1.4.3 實驗大鼠腎臟組織標本留取 血液收集后，將大鼠雙側腎臟小心切除，切除后稱重。之后統一切除肝左葉置于10%的中性福爾馬林溶液中保存，備用于HE染色，其余置于滅活的凍存管中，同時置于超低溫冰箱中保存備用(-78℃)。

1.5觀測指標及方法

1.5.1 一般情況 在整個實驗過程中密切監視大鼠的精神狀態、毛色、大小便以及飲食特點，同時每周對其體重進行一次測量。

1.5.2 24小時尿蛋白排泄量 24小時尿蛋白排泄量由本院檢驗科完成，檢測方法采用雙縮脲法蛋白法，計算公式為：24小時尿蛋白排泄量(mg)=24小時尿蛋白濃度(mg/mL)×24小時尿量(mL)。

1.5.3 血清生化指標 血液Scr、胰島素和血糖等生化指標的檢測嚴格參照說明書進行即可，其中Scr和血糖檢測儀器為分光光度計，胰島素檢測儀器為酶標儀。

1.5.4 HE染色 HE染色參照文獻進行[6]，腎臟組織在用石蠟包埋后給予梯度酒精脫色處理，切片機切片后HE染色即完成，完成后使用蓋玻片密封、光學圖像采集顯微鏡照相即完成。

1.5.5 免疫組化 免疫組化的檢測也參照文獻進行[7]，中性樹膠封片后，采用光學圖像采集顯微鏡照片觀察統計即可，以圖片中棕黃色的位置、多少和深淺判定其表達量。

1.5.6 蛋白表達 Act-A蛋白的檢測方法采用Western Blot法，具體為：(1)將100 mg的腎臟組織置于1 mL的總蛋白提取液中，之后研磨并提取上清液定量，在定量后調平，然后每組各取40 μg進行凝膠電泳，電泳完成后半干轉移法轉膜，轉膜后采用脫脂牛奶密封2小時，2小時后洗滌三次，加入一抗過夜，之后再次洗滌三次后加入二抗密封2小時后即進行ECl發光顯色膠片感光即可，完成后掃描圖像，用Image J計算每個條帶的灰度值，以Act-A/β-actin的灰度值設置為Act-A的相對含量。

1.5.7 半定量PCR Act-AmRNA的檢測采用半定量RT-PCR法，取30 mg腎臟組織用Trial法提取總RNA，提取后定量調平，取2 μg逆轉錄，之后進行擴增，擴增條件為：95℃5分鐘，94℃變性60秒，65℃退火60秒，72℃延伸60秒，共進行35個循環，最后72℃最后延伸5分鐘。在反應完成后，每組給取5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳，最后采用凝膠圖像收集儀收集圖像，image J計算光度值，以Act-A/β-actin的灰度值設置為Act-A的相對含量。具體引物序列見表1。

1.6統計學處理

2 結果

2.1大鼠一般情況

在整個實驗過程中，正常組大鼠毛色光滑發白、飲食和飲水均正常，此外活潑好動，精神活躍；而模型組大鼠在整個實驗過程中死亡2只，可能為血糖過高導致，同時其他存活的大鼠表現有明顯的體型消瘦、飲水量和尿液量較多，毛色發黃、黏連等病理學特點；丹參多酚酸三個治療組在整個治療期間內沒有死亡，但其基本癥狀并沒有明顯好轉，與模型組一致，表現有明顯的多飲多食、精神不活躍等。

2.2對實驗大鼠24小時尿蛋白的影響

在造模前五個組別24小時蛋白尿并沒有明顯差異，而在治療4周和8周后，模型組24小時蛋白尿明顯高于正常組(P<0.05)，而丹參多酚酸三個治療組相較于模型組則明顯降低(P<0.05)，此外丹參多酚酸對24小時蛋白尿呈現明顯的劑量依賴性。詳見表2。

2.3對大鼠血糖和胰島素含量的影響

與正常組相比，模型組血糖值明顯升高(P<0.05)，此外胰島素含量明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，丹參多酚酸高劑量組血糖含量明顯較低(P<0.05)，胰島素含量明顯升高(P<0.05)，而丹參多酚酸低和中劑量組則沒有差異。詳見表3。

表3 大鼠血糖值以及胰島素含量比較

注： 與正常組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

2.4對實驗大鼠的血肌酐及腎臟肥大指數的影響

與正常組相比，模型組腎臟肥大指數以及腎功能指標Scr明顯升高(P<0.05)，丹參多酚酸治療8周后，與模型組相比，丹參多酚酸中劑量和高劑量組腎臟肥大指數明顯低于模型組(P<0.05)，低劑量組則和模型組沒有差異；此外，與模型組相比，丹參多酚酸三個劑量組Scr明顯降低(P<0.05)，且呈明顯的劑量依賴性。詳見表4。

表4 大鼠腎臟肥大指數以及Scr含量比較

注： 與正常組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0. 05。

2.5腎臟病理變化

腎臟組織病理學變化特點采用HE染色觀察，由圖1可以明顯看出，正常組腎小管和腎小球結構完整形態規則，無任何增生反應， 而模型組則有明顯的腎小球肥大癥狀，此外還表現有一定的腎小管萎縮，腎間質系膜增生。丹參多酚酸三個治療組相較于模型組，癥狀明顯好轉，特別是上皮細胞空泡情況明顯改善，同時增生情況也減弱，且隨著丹參多酚酸給藥劑量的增加，癥狀好轉有進一步的劑量依賴性。

表1 大鼠心肌組織中Act-A引物

表2 各組大鼠24小時尿蛋白比較

注： 與正常組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

圖1 各組大鼠腎臟病理改變HE染色圖(×200)

圖2 各組大鼠腎臟組織中Act-A免疫組化圖(×200)

2.6免疫組化

與正常組相比，模型組Act-A含量明顯增高，丹參多酚酸治療后，低劑量組相較于模型組只有略微改善，而中劑量組和高劑量組則有明顯的改善，但相較于正常組仍有較高表達。詳見圖2。

2.7Western bloting和半定量PCR檢測

正常組Act-A蛋白和mRNA表達較少，而模型組表達明顯升高(P<0.05)，高劑量丹參多酚酸治療后，相較于模型組，其表達量明顯降低(P<0.05)。詳見圖3、圖4和表5。

圖3 大鼠腎臟組織中Act-A蛋白表達水平

圖4 大鼠腎臟組織中Act-A mRNA表達水平

組別nAct-AmRNAAct-A蛋白正常組100.28±0.230.36±0.12模型組100.89±0.16a1.72±0.21a低劑量組100.63±0.15a1.01±0.22a中劑量組100.57±0.13a0.79±0.13a高劑量組100.42±0.13ab0.47±0.16ab

注： 與正常組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

3 討論

糖尿病腎病是由糖尿病血糖升高等所帶來的腎臟損害性疾病，目前隨著糖尿病在中國的高發，糖尿病腎病發生率也逐年升高，因此也日益引起醫學工作者的關注，關于其發病機制的研究也形成了眾多的理論[8-10]?，F有的研究證實，異常血糖升高的刺激、血管血流動力學的變化、代謝紊亂、氧化應激、炎癥刺激等多種因素均可以造成糖尿病腎病的發生和發展。而上述的幾條發病因素又相互影響，相互刺激，進而加重了本病的進展[11]。本次課題組采用高脂飲食加一次性鏈脲佐菌素構建糖尿病腎病模型，采用高脂飲食喂養比單純性給予鏈脲佐菌素的優勢在于其所造成的糖尿病腎病大鼠具有明顯的胰島素抵抗性質，與人體糖尿病發展模式相像，此外，采用鏈脲佐菌素一次性注射可以破壞大鼠的胰島細胞，所造成的模型，更符合中晚期糖尿病特點。課題組采用丹參多酚酸治療糖尿病腎病大鼠發現，雖然給予高劑量有一定的降低血糖的效果，但其使用劑量已經達到臨床使用量的2倍，這可能帶來新的問題。

丹參又名紫丹參、赤參、紅根等，中醫理論認為，丹參功效主要為：安神寧心，活血祛瘀，止痛，可治療月經不調、痛經、血崩帶下、經閉、瘀血腹痛、癥瘕以及心絞痛，此外對骨節疼痛、驚悸不眠以及惡瘡腫毒具有較好的療效[12-13]。丹參多酚酸是從丹參中提取的一類化合物，而多酚酸鹽是目前臨床中常用的一種冠心病穩定型心絞痛的藥物，為淺棕色塊狀物，味道微苦，中醫主要將其用于活血化瘀以及舒筋通絡方面，因此在治療心絞痛方面得到廣泛應用[14-15]。而在臨床治療糖尿病心絞痛患者時，課題組發現其對糖尿病引起的腎臟損害具有很好的保護作用，因此考查丹參多酚酸對糖尿病腎臟損害是否有保護作用，研究結果證實，丹參多酚酸對糖尿病腎病大鼠腎臟肥大指數以及血清腎功能指標Scr有著很好的保護作用，且這種保護作用呈現明顯的劑量依賴性，這進一步證實了其對糖尿病腎臟具有很好的保護作用。

丹參多酚酸對腎臟的保護作用可能與Act家族蛋白有關。Act家族蛋白最早發現于性腺，其是有二個13亞基的肽鏈借助于2硫鍵結合而成，主要功能是對細胞的生理過程起到調控作用，特別是對細胞增殖、凋亡以及代謝等的調控[16-17]。有研究顯示[18]，Act一般在體內維持一個正常的平衡狀態，其異常增高或者降低均會造成組織細胞分化，Act蛋白有多種，而與腎臟密切相關的為Act-A蛋白，國外有研究表明[19]，Act-A的過量分泌可以引起腎臟腎小管發生纖維化，進而引起腎臟肌纖維化，最終引起腎臟的損害，而糖尿病本身處于多種因子的刺激下，Act-A可能在腎臟的損害中起到促進作用，因此Act-A可以作為腎小管細胞轉分化的一個標志。本研究發現丹參多酚酸可以明顯降低糖尿病大鼠腎臟組織中Act-A蛋白的表達，組織炎癥反應和增生反應明顯減輕，其機制可能是通過調控Act-A蛋白表達實現的。盡管丹參多酚酸并不是一種有效的降糖藥物，但是對降低大鼠24小時尿蛋白排泄、改善腎小管間質損傷和增生具有很好的作用，這可能與其可以抑制Act-A表達，進而延緩腎臟發生纖維化相關。

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EffectsofDanshenpolyphenolicacidonexpressionofactivinAofkidneytubeinterstitialintype2diabeticnephropathyrats

WANGLing，WUQiufeng.

TianyouHospitalAffiliated，WuhanUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430064，China

WUQiufeng，E-mail：hb70521@126.com

Salvia miltiorrhiza polyphenolic acid； Type 2 diabetes mellitus； Nephropathy； Activin A

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.11.006

2017-02-25)

(本文編輯： 董歷華)

湖北省科技廳資助項目(2015CFC187)

430064 武漢科技大學附屬天佑醫院中醫科

王玲(1982- )，女，碩士，主治醫師。研究方向：中醫基礎與臨床研究。E-mail：904719370@qq.com

吳秋楓(1966- )，女，本科，主任醫師。研究方向：中醫基礎與臨床研究。E-mail：hb70521@126.com

AbstracObjectiveTo observe the effects ofDanshenpolyphenolic acid on the renal function of rats with type 2 diabetes mellitus induced by streptozotocin and high fat diet, meanwhile, analyze its protective mechanism.MethodsFifty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal group, diabetic nephropathy group (model group) and low-dose, middle-dose and high-dose treatment group, 10 rats in each group. After the model was established successfully, the rats were given the corresponding treatment [normal group and model group was given 1 mL/(kg·d) rat body weight,Danshenpolyphenolic acid low, medium and high doses were givenDanshenpolyphenolic acid 5 mg/kg, 10 mg/kg and 20 mg/kg], 8 weeks after the rats were sacrificed, blood glucose, insulin and 24 hours proteinuria were measured. At same time, HE staining was used to detect liver pathology, Western blot, immunohistochemistry and RT-PCR was used to detect the expression of Act-A protein in interstitial.ResultsCompared with the normal group, the blood glucose level in the model group was significantly increased(P<0.05), the insulin was significantly decreased(P<0.05). After treatment withDanshenpolyphenolic acid, the blood glucose in the high dose group was significantly decreased(P<0.05), insulin was significantly increased(P<0.05), while there was no difference between the middle dose group and low dose . Compared with the normal group, the renal hypertrophy index, 24-hour proteinuria and Scr was significantly increased in the model group(P<0.05), and the salivaryol polyphenolic acid was significantly decreased(P<0.05). The pathological results of renal histopathology, in the three treatment groups compared with the model group, the inflammatory response and renal mesangial proliferation were significantly reduced after 8 weeks of treatment. In addition, the result of immunohistochemistry, Western blot and RT-PCR showed that compared with the normal group, the expression of Act-A in the model group was significantly higher than that in the control group(P<0.05), and Act-A was significantly decreased(P<0.05) after treatment withDanshenpolyphenolic acid.ConclusionDanshenpolyphenolic acid has little effect on reducing blood glucose and increasing insulin content in type 2 diabetic rats, but it can significantly improve urinary protein excretion and improve renal tubulointerstitial injury. And it can reduce Act-A expression, and thus delay the renal fibrosis associated.