豆豉發酵常用毛霉和米曲霉菌株產生物胺能力的評價

張仁鳳，陳光靜，楊萬明，黃遠輝，成學東，曾凡玉，闞建全*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715) 2(重慶市農產品加工及貯藏重點實驗室，重慶，400715) 3(農業部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(重慶)，重慶，400715) 4(重慶出入境檢驗檢疫局永川辦事處，重慶，400715) 5(永川豆豉食品有限公司，重慶，400715)

豆豉發酵常用毛霉和米曲霉菌株產生物胺能力的評價

張仁鳳1,2,3，陳光靜1,2,3，楊萬明4，黃遠輝4，成學東4，曾凡玉5，闞建全1,2,3*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715) 2(重慶市農產品加工及貯藏重點實驗室，重慶，400715) 3(農業部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(重慶)，重慶，400715) 4(重慶出入境檢驗檢疫局永川辦事處，重慶，400715) 5(永川豆豉食品有限公司，重慶，400715)

采用微生物學、高效液相色譜、分子生物學技術(PCR)和酶學技術，系統檢測和評價了豆豉發酵中常用的6株毛霉和米曲霉菌株產生物胺的情況。研究結果表明，采用微生物學、高效液相色譜、分子生物學技術(PCR)和酶學4種評價方法所得評價結果基本一致，總狀毛霉、雅致放射毛霉、五通橋毛霉、米曲霉2339、米曲霉41380、米曲霉40188這6株試驗菌株均產生酪胺，雅致放射毛霉和3株米曲霉能產生色胺，3株米曲霉能產生腐胺，而僅總狀毛霉具有組氨酸脫羧酶活性。霉菌代謝產生生物胺及產生生物胺的種類和含量無種屬特異性，但有菌株個體特異性。

豆豉；生物胺；毛霉；米曲霉；氨基酸脫羧酶

生物胺是一類含氮低分子量有機化合物[1]，廣泛存在于多類食品中，對人體細胞發揮正常生理功能起著重要作用，但攝入的濃度過高會對人體產生毒害作用，造成人體心血管和神經系統的損傷[2]。其中，組胺毒性最大，酪胺次之[3]。腐胺和尸胺雖然本身的毒性很低，但是它們的存在會使組胺和酪胺的毒性增強[4]。豆豉是以黃豆或大豆為主要原料，利用曲霉、毛霉或者細菌制曲產生的復雜酶系，分解大豆中營養物質發酵而成的一種傳統豆制品[5]，可以分為細菌型、米曲霉型、毛霉型和根霉型豆豉等[6]。生物胺的形成通常需要滿足以下3個條件[7-8]：含游離氨基酸、存在產氨基酸脫羧酶的微生物和微生物生長的有利環境。豆豉發酵過程中微生物代謝產生的氨基酸脫羧酶能催化相應的游離氨基酸脫羧生成相應的生物胺。此外，游離氨基酸大量存在于豆豉中，所以控制豆豉中生物胺含量的關鍵在于控制豆豉發酵過程中能夠產生生物胺的微生物的種類和數量。

本研究采用微生物學、高效液相色譜及分子生物學技術，同時結合測定菌株氨基酸脫羧酶活性，以評價發酵豆豉常用的6株霉菌產生物胺的情況，重點評價其產組胺、酪胺和腐胺的能力。

1 材料與方法

1.1試驗菌株

總狀毛霉(Mucorracemosus)、雅致放射毛霉(Actinomucorelegans)、五通橋毛霉(Mucorwutungkiao)、米曲霉2339(滬釀3.042)(Aspergillusoryzae2339)、米曲霉41380(Aspergillusoryzae41380)、米曲霉40188(Aspergillusoryzae40188)6株霉菌，購自中國工業微生物菌株保藏管理中心(CICC)。

1.2培養基

麥芽浸粉肉湯(MEB)培養基(g/L)：麥芽浸粉20，pH 6.9±0.2，121 ℃高壓滅菌15 min。

麥芽浸粉瓊脂(MEA)培養基(g/L)：麥芽浸粉30，大豆蛋白胨3，瓊脂15，蒸餾水，pH 5.6±0.2，121 ℃高壓滅菌15 min。

液體生物胺檢測培養基[9](g/L)：MEB培養基中添加 5'-磷酸吡多醛 0.05，溴甲酚紫 0.06，前體氨基酸(L-組氨酸、L-酪氨酸、L-賴氨酸、L-鳥氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-苯丙氨酸)各1.0，pH5.3，121 ℃高壓滅菌15 min。

1.3主要試劑

生物胺標準品：腐胺(≥98%)、尸胺(≥98%)、色胺(≥98%)、2-苯乙胺(≥98%)、精胺(≥98%)、亞精胺(≥98%)、組胺(≥99%)、酪胺(≥99%)；5′-磷酸吡哆醛、苯甲酰氯(≥99%)、酪氨酸脫羧酶標準品，美國Sigma公司；甲醇(色譜純)，成都科龍化工試劑廠；L-組氨酸、L-酪氨酸、L-賴氨酸、L-鳥氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸、L-苯丙氨酸(分析純)，BIOSHARP公司；Tris、PEP單環己胺鹽(>98%)，生工生物工程(上海)股份有限公司；磷酸稀醇式丙酮酸(PEP)羧化酶(5 U/mg)、固紫B(≥60%)，上海寶曼生物科技公司；總蛋白定量測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；DNA提取試劑盒，Omega公司；2×Tap mastermi，天根生化科技有限公司；瓊脂糖，Biowest Agarose。其他試劑均為分析純。

1.4主要儀器與設備

SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業醫療設備廠；DHP-9272型恒溫培養箱，上海齊欣科學儀器有限公司；Agilent 1260型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；5810型冷凍離心機，德國Eppendorf公司；PGC-21D型可調式氮吹儀，北京中諾遠東公司；UV-2450S(E)型紫外分光光度計，日本島津公司；溫度梯度PCR儀、凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司；瓊脂糖凝膠水平電泳裝置，北京東方儀器廠。

2 試驗方法

2.1菌種的活化

購買菌種為凍干管，打管后用無菌滴管吸取0.5 mL左右MEB培養基于凍干管中溶解全部凍干菌粉，然后將溶解后的菌懸液轉移至盛有4～5 mL MEB培養基的試管中混勻，并取100 μL轉接到MEA培養基上。28 ℃靜置培養5～7 d，連續傳代3次，進行活化。

2.2試驗菌株產胺能力的微生物學顯色法

將活化后的試驗菌株，分別接種于裝有一定量液體生物胺檢測培養基的試管中進行檢測，做3組平行，將不接種菌株的空白試管作為對照試驗。28 ℃培養5 d后，觀察培養基顏色變化。

2.3試驗菌株產胺能力的HPLC測定法

2.3.1 生物胺標準曲線的繪制

準確稱取腐胺、尸胺、色胺、2-苯乙胺、亞精胺、精胺、組胺和酪胺標準品各50 mg于50 mL的容量瓶中，用0.1 mol/L的HCl定容，制成標準儲備液，于4 ℃保存備用。

分別吸取上述標準儲備液，用0.1 mol/L的HCl稀釋，配制成終質量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、40、60和80 μg/mL的混合標準溶液。然后按2.3.2進行柱前衍生處理并上機分析，繪制出生物胺標準曲線。

2.3.2 生物胺測定的柱前衍生

吸取2 mL上述各濃度的生物胺混合標準溶液，分別加入2 mol/L NaOH溶液1 mL和苯甲酰氯10 μL，旋渦振蕩混勻后，在30 ℃下避光反應40 min，期間每10 min振蕩混勻1次。反應完成后，加入飽和NaCl溶液2 mL中斷反應。然后加入無水乙醚3 mL進行萃取，1 200 r/min離心10 min后，小心移取乙醚層于10 mL離心管中，再重復萃取1次，合并乙醚層。用氮吹儀35 ℃下吹干，最后用 1 mL甲醇(色譜級)溶解，過有機相0.45 μm濾膜后進行HPLC分析[10]。

2.3.3 樣品的預處理[11]

將活化后的試驗菌株接種于麥芽浸粉肉湯(MEB)培養基中培養24 h后，吸取1 mL菌懸液加入9 mL添加了0.1%前體氨基酸(L-組氨酸、L-酪氨酸、L-賴氨酸、L-鳥氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸和L-苯丙氨酸) 的MEB培養基中。28 ℃靜置培養5 d后，吸取培養液2 mL，加入0.1 mol/L HCl溶液2 mL， 4 ℃、12 000 r/min離心5 min，小心吸取上清液2 mL按照2.3.2中的方法進行衍生處理。

2.3.4 液相色譜分析條件

色譜柱：Agilent XDB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流動相A和B:超純水和甲醇；流速：1.0 mL/min，進樣量：20 μL，紫外檢測波長：254 nm，柱溫：30 ℃[12-13]。進行梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.4試驗菌株產胺能力的分子生物學檢測法

2.4.1 試驗菌株DNA的提取

按照DNA提取試劑盒(Omega Fungal DNA Kit)的操作要求分別提取試驗菌株的DNA，分裝后于-20 ℃冰箱待用。

2.4.2 引物的設計與選擇

目前，用于擴增毛霉中氨基酸脫羧酶基因片段的特異性引物尚未有文獻報道，本試驗選用了文獻[14-20]中報道最多的10對用于擴增乳酸菌氨基酸脫羧酶片段的引物，以及根據NCBI數據庫中查出已報道的米曲霉中鳥氨酸和酪氨酸脫羧酶序列設計的2對引物Tdc-F/Tdc-R和Odc-F/Odc-R，它們分別可以特異擴增出組氨酸脫羧酶基因片段、酪氨酸脫羧酶基因片斷和鳥氨酸脫羧酶基因片斷。本試驗所用引物的設計與合成均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。引物序列及擴增片段長度見表2。

表2 試驗所用引物

2.4.3 PCR擴增氨基酸脫羧酶基因片段

①25 μL擴增體系：2×Tapmastermix 12.5 μL，引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 1 μL，加雙蒸水補足至25 μL。充分混勻后，進行PCR擴增。

②PCR擴增條件[17]：95 ℃預變性，5 min；循環30次；95 ℃變性，45s；50 ℃退火，1 min；72 ℃延伸，1 min；72 ℃終延伸，10 min。最后將PCR擴增產物在1.4%瓊脂糖凝膠上進行電泳驗證。

2.4.4 PCR擴增產物的測序及同源性分析

將所得的PCR擴增產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，測定結果在NCBI的Blast進行同源性分析。

2.5試驗菌株氨基酸脫羧酶活力的測定

采用鄧歡[21]的一種快速定量檢測氨基酸脫羧酶活力的比色方法測定，稍作如下修改。

2.5.1 氨基酸脫羧酶標準曲線的繪制

準確稱取酪氨酸脫羧酶標準品，用勻漿介質(pH 7.4，0.01 mol/L Tris-HCl，0.000 1 mol/L EDTA-2Na， 0.8% NaCl溶液，0.01 mol/L蔗糖)配制成終濃度分別為0、0.001、0.002、0.003、0,004、0.005、0.006、0.007 U/μL的標準溶液備用。

吸取反應液450 μL (pH 7.5，50 mmol/L Tris， 2 mmol/L PEP單環己胺鹽，10 mmol/L MgCl2，1 U/mL 磷酸稀醇式丙酮酸羧化酶，5 mmol/L酪氨酸，現配現用)于已編號的1.5 mL離心管中，對應加入上述不同濃度的酪氨酸脫羧酶標準溶液50 μL，旋渦振蕩混勻后，于37 ℃下反應1 h，每隔10 min振蕩混勻1次。反應完成后，加入顯色液25 μL(50 mg/mL 固紫B，1% 吐溫80溶液，以上所配溶液均采用無CO2蒸餾水配置)，旋渦振蕩混勻。靜置5 min后用光徑1 cm的比色皿，蒸餾水調零，空白管用勻漿介質代替標準品，于520 nm處測定各管吸光值。以吸光值為縱坐標，以標準品酪氨酸脫羧酶活力單位(U)為橫坐標，繪制標準曲線，獲得線性方程：y=0.527 4x+0.098 5，R2=0.998 5。

因本氨基酸脫羧酶活力測定的原理是通過捕捉氨基酸脫羧酶催化前體氨基酸脫羧形成胺而釋放的CO2顯色，故不同種類的氨基酸脫羧酶的活力均可按上述線性方程來計算(同時做空白對照來排除試劑與樣品造成的顏色誤差，用絕對OD值進行計算)。

2.5.2 試驗菌株樣品的前處理

將試驗菌絲放入干凈的研缽中，在液氮條件下充分研磨至白色粉末后，立即轉移至預冷的2 mL離心管中，加入適量預冷的無菌生理鹽水。用超聲波細胞粉碎機冰浴處理3 min，每超聲3 s間隔7 s，功率為300 W。破碎液于4 ℃、16 000 r/min離心15 min。最后小心移取上清液至預冷的無菌1.5 mL離心管中，置于冰上待測。

2.5.3 試驗菌株樣品的測定

將預處理后的菌絲樣品按照2.5.1中的方法測定吸光值，代入所得標準曲線的線性方程中算出對應的氨基酸脫羧酶活力E實際(U)。樣品氨基酸脫羧酶比活力(U/mg pro)E樣品=E實際×稀釋倍數/總蛋白濃度，其中樣品的總蛋白濃度采用總蛋白定量測定試劑盒(考馬斯亮藍法)測定。

2.6試驗數據處理

做3組平行試驗，數據采用Excel 2010與Vector NTI 11軟件進行統計分析和處理，其中以p<0.05說明差異顯著，采用SPSS兩兩比較進行顯著性分析。

3 結果與分析

3.1試驗菌株產胺能力的微生物學法顯色結果

利用液體生物胺檢測培養基顯色法，對6株試驗菌株產生物胺的情況進行初步檢測。由圖1可以看出，相較于未接菌株的空白對照管，氨基酸脫羧酶陰性管表面有菌絲生長且培養基呈現黃色，因為其沒有催化游離氨基酸脫羧產生堿性生物胺的能力，培養基酸堿度沒有發生改變。而氨基酸脫羧酶陽性管同樣有菌絲生長，其可以催化游離的前體氨基酸脫羧產生生物胺，使培養基偏堿性，而最終呈現紫紅色或紫色。

圖1 液體生物胺檢測培養基的檢測結果Fig.1 Test result of liquid biogenic amine detection medium

微生物顯色法檢測結果見表3。除五通橋毛霉外，其余5株試驗霉菌均能夠產生不同種類的生物胺，其中5株霉菌產生酪胺，4株霉菌產生色胺，3株霉菌產生腐胺，但只有1株霉菌(總狀毛霉)具有組氨酸脫羧酶活性。但是，由于微生物學顯色法自身存在一定的局限性，容易出現假陽性或假陰性結果，故需要進一步與其他方法結合驗證。

表3 試驗菌株氨基酸脫羧酶活性的的培養基檢測結果

注:+表示陽性；-表示陰性。

3.2試驗菌株產生物胺能力的HPLC法測定結果

3.2.1 標準曲線的繪制

由圖2可知，在液相圖譜上各種生物胺的苯甲酰氯衍生物的分離效果較好，在18 min內8種生物胺苯甲酰氯衍生物全部岀峰，速度較快。各生物胺的回歸方程及相關系數，見表4。結果表明，該HPLC法測定的8種生物胺標品，在0.50～80.0 μg/L范圍內線性關系良好(R>0.995)，說明用該方法來測定8種生物胺具有良好的可靠性。

圖2 生物胺混合標準品溶液的液相色譜圖Fig.2 Chromatogram of biogenic amines standards

生物胺回歸方程相關系數R2線性范圍/(μg·L-1)保留時間/min腐胺y=101.45x+114.930.99740.50-80.06.018尸胺y=70.003x+61.3110.99850.50-80.06.875色胺y=52.319x+139.90.99890.50-80.08.2212-苯乙胺y=51.88x+43.7240.99930.50-80.09.601亞精胺y=69.215x+73.7830.99610.50-80.010.249精胺y=72.624x+45.6210.99840.50-80.013.523組胺y=24.692x-20.6640.99730.50-80.014.990酪胺y=40.771x+92.0620.99790.50-80.017.592

3.2.2 HPLC測定試驗菌株培養液中生物胺含量的結果

由表5可知，6株菌均產酪胺，含量在1.19～6.57 μg/mL之間；3株菌產腐胺、色胺和精胺，其含量分別在1.02～3.57 μg/mL、0.6～23.91 μg/mL和23.96～72.81 μg/mL之間；僅1株菌產組胺，含量為1.42 μg/mL。與表3得出的結果大致相同。

3.3試驗菌株氨基酸脫羧酶活力的測定結果

由表6可以看出，6株菌均具有酪氨酸脫羧酶活力，且活力大小在1.45～6.34 U/mg(pro)；4株菌具有色氨酸脫羧酶活力，活力大小在1.26～8.00 U/mg(pro)；3株菌具有鳥氨酸脫羧酶活力，活力大小在1.35～6.37 U/mg(pro)；僅有1株菌檢測出具有組氨酸脫羧酶活力。結合表5各試驗菌株的產生物胺能力大小可看出其對應氨基酸脫羧酶活力均與產各生物胺含量成正相關。

表5 試驗菌株培養液中生物胺的HPLC測定結果

注:ND表示未檢出，同一列相同字母表示差異不具有顯著性(p>0.05)。

表6 試驗菌株氨基酸脫羧酶活力的測定結果

注:“—”表示未檢測出氨基酸脫羧酶活力。

3.4試驗菌株產生物胺能力的分子生物學法檢測結果

3.4.1 鳥氨酸、組氨酸和酪氨酸脫羧酶基因的PCR擴增結果

使用12對不同試驗引物分別進行PCR擴增，結果表明：以6株試驗菌株DNA為模板，以Odc-F/Odc-R和Tdc-F/Tdc-R為引物，檢測到3株米曲霉均攜帶有鳥氨酸脫羧酶基因和酪氨酸脫羧酶基因。其PCR 擴增條帶的瓊脂糖凝膠電泳圖如圖3。

圖3 PCR法檢測鳥氨酸脫羧酶和酪氨酸脫羧酶基因Fig.3 PCR detecting for ODC and TDC gene

可以看出擴增條帶清晰，且與目標條帶大小相符。而其他10對試驗引物PCR均擴增不出相應的目標條帶，說明用于擴增乳酸菌和米曲霉中氨基酸脫羧酶基因片段的引物不適用于擴增霉菌中氨基酸脫羧酶基因片段，故毛霉中氨基酸脫羧酶基因序列還有待進一步研究。

3.4.2 鳥氨酸和酪氨酸脫羧酶基因序列同源性分析

將3株米曲霉鳥氨酸脫羧酶和酪氨酸脫羧酶的PCR擴增產物進行測序，測序結果在NCBI的Blast上進行同源性比對。分析結果表明Aspergillusoryzae2339，Aspergillusoryzae41380，Aspergillusoryza40188的PCR擴增序列均與AspergillusoryzaeR1B40的鳥氨酸脫羧酶基因和酪氨酸脫羧酶基因序列具有高度同源性(99%)，可初步證明該PCR擴增產物分別是鳥氨酸脫羧酶基因片段和酪氨酸脫羧酶基因片段。

然后使用Vector NTI 11軟件進行比對，黃色部分表示堿基完全一致，藍色和空白區域表示個別堿基略有差異。由比對結果可明顯看出，3株試驗米曲霉鳥氨酸脫羧酶和酪氨酸脫羧酶的PCR擴增產物測序結果與NCBI已報道的鳥氨基酸脫羧酶和酪氨酸脫羧酶的序列具有高度同源性。由此可以證明采用PCR法擴增得到的基因序列確定為鳥氨基酸脫羧酶基因序列和酪氨酸脫羧酶序列。

4 結論

結合微生物學、高效液相色譜(HPLC)、分子生物學技術(PCR)和酶學技術4種方法，檢測出總狀毛霉、雅致放射毛霉、五通橋毛霉、米曲霉2339、米曲霉41380、米曲霉40188這6株試驗菌株均產生酪胺，雅致放射毛霉和3株米曲霉能產生色胺，3株米曲霉能產生腐胺，而僅總狀毛霉具有組氨酸脫羧酶活性?？梢?，霉菌產生物胺的種類和含量無種屬特異性，但有菌株特異性，即同一種屬不同菌株產生物胺的能力各不相同，但還需要通過實際生產來進一步驗證說明。

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EvaluationofbiogenicaminesproducedbyMucorandAspergillusoryzaeinDouchifermentationprocess

ZHANG Ren-feng1,2,3,CHEN Guang-jing1,2,3,YANG Wan-ming4,HUANG Yuan-hui4, CHENG Xue-dong4,ZENG Fan-yu5,KAN Jian-quan1,2,3*

1(College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400715， China) 2(Key Laboratory of Products Processing and Storage of Chongqing,Chongqing 400715， China) 3(Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Agro-products on Storage and Preservationg (Chongqing), Ministry of Agriculture,Chongqing 400715,China) 4(Chongqing Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau Yongchuan Office，Chongqing 400715， China) 5(Yongchuan Douchi Food company limited，Chongqing 400715,China)

The change of biogenic amines content produced by 6 strains ofMucorandAspergillusoryzaein Douchi fermentation process was analyzed using four methods including microbial method, high performance liquid chromatography (HPLC), molecular biology technology (PCR) and the enzyme technology. The results showed that similar results were obtained using these four methods. Six strains ofMucorracemosus,Actinomucorelegans,Mucorwutungkiao,Aspergillusoryzae2339,Aspergillusoryzae41380 andAspergillusoryzae40188 could produce tyramine.Actinomucorelegansand 3 strains ofAspergillusoryzaecould produce tryptamine. Three strains ofAspergillusoryzaecould produce putrescine. OnlyMucorracemosushad histidine decarboxylase activity. Whether mold metabolism produced biogenic amines was not species-specific, but strains-specific.

douci; biogenic amines;Mucor;Aspergillusoryzae; amino acid decarboxylase

碩士研究生(闞建全教授為通訊作者，E-mail：ganjq1965@163.com)。

重慶市永川區科技計劃項目(Ycstc,2015ac1015)“永川毛霉型豆豉中生物胺控制的關鍵技術研究與應用(2015)”資助；重慶市現代特色效益農業技術體系創新團隊建設調味品產業技術體系項目(2017[7]號)

2017-05-05，改回日期：2017-06-06

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014726