啤酒主要組分在泡沫中的富集及其對泡持性的影響

田金鳳，王金晶，鄭飛云，李永仙，劉春鳳，鈕成拓，李崎*

1(江南大學,工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫，214122) 2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

啤酒主要組分在泡沫中的富集及其對泡持性的影響

田金鳳1,2，王金晶1,2，鄭飛云1,2，李永仙1,2，劉春鳳1,2，鈕成拓1,2，李崎1,2*

1(江南大學,工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫，214122) 2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

為了探究啤酒中影響泡沫穩定性的主要組分在泡沫生成液中的富集情況，對14種市售啤酒的泡沫生成液、殘液、原液進行了分離和收集，并對其中蛋白質、總糖、總多酚的含量以及啤酒的泡持性進行了檢測。結果顯示，蛋白質在啤酒泡沫中有非常明顯的富集，泡沫生成液中蛋白質質量濃度比啤酒殘液中高27～74 μg/mL，比啤酒原液中高16～58 μg/mL，而糖類和多酚則沒有明顯的富集。將3種組分的含量分別與啤酒泡持性進行相關性分析和偏相關性分析，結果表明：(1)蛋白質含量與泡持值之間始終存在很強的正相關，是維持泡沫穩定性的重要因素；(2)糖類能夠通過提高啤酒體系黏度、與蛋白質進行共價結合等方式從側面對啤酒泡持有積極作用；(3)多酚可能與蛋白質交聯進而提高泡沫穩定性，但其影響相對較小。

泡持性；蛋白質；糖類；富集；相關性

啤酒是一種營養豐富、歷史悠久，且酒精含量較低的飲料酒，至今已有上千年的歷史[1]。啤酒泡沫作為其重要的外觀特征之一，是釀酒工程師和消費者們評價啤酒質量的一個重要指標[2]。根據歐洲釀造協會的規定，啤酒的泡沫性能評價指標包括起泡性、穩定性、掛杯性、泡沫外觀4個部分。其中，泡沫穩定性是最為重要指標，也成為了學者們的研究重點[3]。啤酒泡沫的形成過程較為復雜，在開啟啤酒瓶及傾倒啤酒時，啤酒瓶內氣壓突然減小，啤酒中溶解的過飽和的CO2形成氣泡晶核并釋放出來。氣泡逐漸上浮，膨脹堆積，最終形成啤酒泡沫。泡持性除了受啤酒自身的黏度、疏水性等因素影響外，還受到啤酒中蛋白質等多種組分影響，其中影響啤酒泡沫性質的主要組分有蛋白質、糖類、多酚和異α-酸，而酒精、pH等與泡沫穩定性的相關性很弱[4-9]。

糖類是啤酒中含量最高的物質，但對于糖類尤其是高分子量的多糖對啤酒泡沫穩定性的影響仍存在爭議。SARKER等人研究發現，一定量的阿拉伯木聚糖能夠提高體系的黏度，與蛋白質交聯而提高泡沫穩定性，因此認為阿拉伯木聚糖可以提高啤酒泡沫穩定性[10]。而LUSK等人對啤酒泡沫進行富集后發現，β-葡聚糖在泡沫中沒有富集，同時對β-葡聚糖的酶解測試發現，糖化過程中加入β-葡聚糖酶后葡聚糖被降解減少，而啤酒的結果不變，因此認為β-葡聚糖對啤酒泡沫穩定性作用不大[11]。目前關于糖類對啤酒泡沫的影響尚沒有明確的結論，仍需要進一步的研究。蛋白質是啤酒中含量較為豐富的另一種物質，國內外關于蛋白質的研究主要集中在對啤酒泡沫蛋白種類的鑒定和分析[12-16]，原料中的水溶性蛋白是啤酒泡沫蛋白的最主要來源，其次為酵母在發酵過程中代謝產生的蛋白質。這些蛋白質能夠耐高溫、抗酶解，經過糖化煮沸發酵等一系列過程，最終存在于啤酒中。目前已經鑒定出來的主要有蛋白質Z、脂轉移蛋白、大麥α-淀粉酶抑制劑二聚體-1、大麥醇溶蛋白等[17-18]。多酚是啤酒中另一種含量較高的物質，但目前關于多酚與啤酒泡沫之間的關系的研究較少。BAMFORTH[19]認為多酚與異-α酸作用相似，通過與蛋白質結合以提高泡沫穩定性。而另一方面，在煮沸和釀造過程中，多酚會引起蛋白質特別是渾濁活性蛋白沉淀析出，因此可能會對啤酒泡沫產生一定的負面作用。另外，啤酒中的其他物質如酒精、金屬離子等也對泡沫有一定的影響。常認為酒精對啤酒泡沫有著負面的影響，高濃度的乙醇加入泡沫中會直接導致泡沫坍塌。而金屬離子的存在有利于提高泡沫穩定性，但在極端情況下可能會導致噴涌。而CO2則無疑是絕對啤酒泡沫質量的重要因素，增加CO2的濃度會形成更多的氣泡晶核并提高泡沫穩定性[19]。

目前關于啤酒中影響泡沫性能組分的研究，集中于對啤酒原液中組分的研究，而對啤酒起泡后形成的泡沫液中各種組分的研究較少，對于啤酒中各成分在泡沫中的富集情況仍不清晰。而啤酒泡持性主要依靠起泡后形成的泡沫的穩定性，泡沫液中的各組分及其含量也對啤酒泡持性有一定的影響。本論文選取蛋白質、總糖和總多酚3個指標，對14種市售啤酒的泡沫生成液、原液、殘液中這3種組分的含量進行檢測以探究不同組分在啤酒泡沫中的富集程度。另一方面，為了探究3種組分之間是否存在相互作用而對啤酒泡沫穩定性有積極的貢獻通過相關性分析和偏相關性分析相結合的方法，在考察各種組分與泡持性的相關性的同時，探究啤酒組分之間的關系及共同作用。

1 材料與方法

1.1樣品

選取14種市售啤酒作為分析樣品。測定泡持性時使用原啤酒樣品，其他指標測定時需將樣品進行超聲除氣。酒樣信息如表1所示。

表1 實驗所用啤酒的信息

1.2試劑

Bradford蛋白濃度測定試劑盒(上海生工)、苯酚、濃硫酸、羧甲基纖維素試劑(CMC/EDTA)、綠色檸檬酸鐵銨、氨水等。

1.3儀器與設備

超聲波清洗器，昆山超聲儀器；20 ℃恒溫水浴鍋，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；UV-2000型分光光度計，美國Unico公司；漩渦攪拌器，美國Scientific Industries公司。

1.4實驗方法

1.4.1 啤酒泡持值的測定

啤酒泡持性測定采用超聲振蕩法。每個樣品均做3次平行實驗，取平均值。

將啤酒樣品置于20 ℃恒溫水浴鍋中恒溫30 min后，使用250 mL量筒準確量取適當體積的啤酒樣品(量取過程應盡量避免泡沫的產生)并記錄體積(VTotal)。然后將量筒置于超聲振蕩儀中，在28 kHz的振蕩頻率下振蕩15 s。取出記錄振蕩開始后30、60、90、120、150、180、210 s時刻對應的液體體積VLiquid，此時形成泡沫液體的體積記為VFoam，即VFoam=VTotal-VLiquid。以時間為橫坐標，lnVFoam為縱坐標作圖，求得線性趨勢方程的率斜k。

(1)

1.4.2 泡沫生成液的收集

沿1 L的分液漏斗邊緣將啤酒樣品勻速倒入，至泡沫達到800 mL刻度線。10 s后打開出樣閥將液體放出至泡沫恰好流出立即關閉出樣閥，泡沫消失后收集得到泡沫生成液，同時收集放出的樣品(殘液)備用。

1.4.3 泡沫生成液、啤酒原液、殘液中的蛋白質含量測定

采用Bradford法測定蛋白質濃度。將試劑盒中的5 mg/mL的牛血清白蛋白用試劑盒中的PBS稀釋至200 μg/mL。取8只2 mL離心管標記為1-8號，分別加入0、15、30、60、90、120、150、225 μL，200 μg/mL的BSA標準溶液，并補PBS至300 μL。另取1.5 mL離心管并標記，分別加入150 μL相應濃度的BSA標準溶液和1.5 mL的Bradford試劑，室溫下搖勻放置5 min，使用分光光度計測定595 nm下的吸光度，其中1號為空白。以蛋白質量濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線。測定樣品時，分別取75 μL樣品、75 μL去離子水，加入1.5 mL Bradford試劑，反應5 min后在595 nm下測定吸光值，根據標準曲線計算樣品中蛋白質量濃度。

1.4.4 泡沫生成液、啤酒原液、殘液中的總糖含量的測定

采用ASBC中的濃硫酸-苯酚分光光度法[20]。取2 mL稀釋后的樣品于試管中，加入1 mL 50 g/L苯酚溶液，攪拌，吸取5 mL濃硫酸于試管中部，立即以漩渦攪拌器混合；以含2 mL水、1 mL苯酚溶液和5 mL硫酸作為空白對照，含2 mL葡萄糖校準溶液、1 mL苯酚溶液和5 mL硫酸作為校正。在490 nm條件下，用蒸餾水調零后，分別測定空白、標準液和各個樣品的吸光度。計算公式：

啤酒中總碳水化合物/[g·(100mL)-1]=[0.9×(樣品吸光度-空白吸光度)×2×稀釋度]/[(校準溶液吸光度-空白吸光度)×1 000]

(2)

1.4.5 泡沫生成液、啤酒原液、殘液中的總多酚含量的測定

采用ASBC中的國際方法[20]。配制1%CMC鈉鹽(低黏度)溶液加0.2%的乙二胺四乙酸(EDTA)，3.5%綠色檸檬酸鐵銨溶液，V(去離子水)∶V(濃氨水)=2∶1的氨水溶液。向25 mL容量瓶中加入10 mL樣品和8 mL CMC/EDTA并混合；加入0.5 mL綠色檸檬酸鐵銨溶液并混合；再添加0.5 mL稀釋后的氨水溶液并混合均勻。加水制備得25 mL體系，再次混合。室溫下靜置10 min后，600 nm下測定吸光值，其中空白樣品為包含10 mL樣、8 mL CMC/EDTA、0.5 mL稀釋后的氨水的25 mL體系。

總多酚含量(mg/L)=吸光值×820

(3)

2 實驗結果

2.1啤酒泡持性的測定

采用超聲振蕩法，對14種市售啤酒進行泡持性測定，每種樣品測定3次并取平均值，結果如圖1所示。結果顯示，由于原料、原麥汁濃度、釀造工藝的不同，啤酒的泡持值差異較大，處于158～320 s之間。

圖1 啤酒的泡持性Fig.1 Foam retention of beer

2.2啤酒泡沫生成液、原液、殘液中的蛋白質濃度對比

對14種市售啤酒樣品分離后的泡沫生成液、殘液以及啤酒原液中的蛋白質含量均進行了考察，結果如圖2所示。

由圖2可以看出，14種樣品，啤酒泡沫生成液中的蛋白質含量均遠高于啤酒原液和殘液中的蛋白質含量。同時，不同種啤酒的蛋白質含量差異較大。啤酒泡沫生成液中的蛋白質質量濃度比啤酒殘液中的蛋白質濃度高27～74 μg/mL，比啤酒原液中的蛋白質質量濃度高16～58 μg/mL。蛋白質能夠在啤酒泡沫中富集，主要原理是蛋白質具有一定的表面活性，當啤酒瓶被打開時，瓶內過飽和的CO2被釋放出來形成氣泡并逐漸上浮，在氣泡上升的過程中蛋白質能夠吸附在氣-液界面并被帶到泡沫中，最終在啤酒泡沫中實現富集泡沫。蛋白在啤酒泡沫中的富集，一方面取決于蛋白質本身的性質，另一方面取決于啤酒體系的黏度。當啤酒體系中黏度較大時，富集效果越好。蛋白質在啤酒氣泡形成過程中有非常明顯的富集這一現象，充分說明蛋白質是維持泡沫穩定性的重要組分，對維持泡沫的穩定性有重要意義。

2.3啤酒泡沫生成液、原液、殘液中的總糖含量對比

目前關于糖類對啤酒泡沫性質的影響認知不一，有學者認為麥芽中的葡聚糖、阿拉伯木聚糖甚至寡糖能夠提高酒液的黏度，進而對啤酒泡沫穩定性有著積極的影響[6]。韓宇鵬等人則認為在糖化和煮沸過程中，糖類能夠和蛋白質共價結合，改變蛋白質的結構和理化性質，從而提高啤酒的泡沫穩定性[21]。本實驗用濃硫酸-苯酚法考察了啤酒泡沫生成液、殘液和原液中的總糖含量，結果見圖3。實驗結果顯示，同一種啤酒的這3個部分中，總糖含量幾乎沒有差別，說明在啤酒起泡的過程中，糖類沒有明顯的富集，而是較為均勻地分散在所有體系中。啤酒中的糖類不能在泡沫中富集，可能是由于啤酒中的多數糖類不具有表面活性，因而不能隨著氣泡的生成而吸附到氣液界面上。糖類不是能夠直接維持啤酒泡沫穩定性的組分，推測認為糖類可能是通過改善含有蛋白質的啤酒體系的黏度和蛋白質的功能性質，進而改善啤酒的泡沫穩定性。

圖3 啤酒的泡沫生成液、原液、殘液中總糖含量對比Fig.3 Total saccharide contents of liquid of beer foam,residue liquid and original beer

2.4啤酒泡沫生成液、原液、殘液中的總多酚含量對比

多酚在影響啤酒風味的同時，也對啤酒的非生物穩定性有一定的影響。BAMFORTH等人認為，多酚與異-α酸作用相似，通過與蛋白質結合以提高泡沫穩定性。多酚的含量與泡沫穩定性有很強的相關性。對啤酒泡沫生成液、原液、殘液中的總多酚含量進行檢測，結果顯示如圖4?？偠喾雍吭谕N啤酒的不同部分的分布沒有明顯趨勢，差異較小，說明在啤酒起泡的過程中，多酚也沒有得到明顯的富集。

圖4 啤酒的泡沫生成液、原液、殘液中總多酚含量對比Fig.4 Total polyphenol contents of liquid of beer foam,residue liquid and original beer

2.5相關性分析及偏相關性分析

啤酒泡持性受蛋白質、糖、多酚等多重因素的影響，變量之間的相關關系十分復雜，單純地分析某一種組分與泡持性之間的線性關系不足以反映他們之間的關系。因此本研究除將不同組分與啤酒泡持性進行相關性分析之外，同時采用偏相關性分析探究在對其他變量進行控制時，更加準確地反映各種組分與啤酒泡持性之間的線性相關程度及組分直接的相互作用。

偏相關性分析也稱凈相關性分析，是指剔除其他相關因素影響的條件下計算出的變量之間的相關性，例如本研究中對總糖含量與泡持性之間進行偏相關性分析，即為在剔除蛋白質、多酚影響的條件下計算出的相關性。本研究使用Spss Statistic 21軟件分別對啤酒原液和泡沫生成液中的組分與泡持值之間進行相關性分析和偏相關性分析。

2.5.1 蛋白質含量和泡持值的相關性分析

對啤酒原液和泡沫生成液中的蛋白質含量與啤酒泡持值分別進行相關性分析和偏相關性分析，結果如表2所示。

表2 不同組間蛋白質含量和泡持值的相關性及偏相關性分析

注：相關分析采用pearson相關分析， **p<0.01。

從表2可以看出，啤酒原液中和泡沫中蛋白質含量與啤酒泡持性的相關系數差別不大，以啤酒原液中的數據進行分析，結果顯示：啤酒原液中的蛋白質濃度與啤酒泡持性的相關系數為0.875(p<0.01)，說明蛋白質含量與泡持值之間有很強的正相關；偏相關性分析結果顯示，控制變量總糖含量和總多酚含量后，蛋白質濃度與啤酒泡持性的偏相關系數為0.821(p<0.01)。將兩項結果結合分析，啤酒中蛋白質含量與泡持值之間存在很強的正相關，而當啤酒中不存在糖類和多酚時，蛋白質含量與泡持性的相關性有一定程度的降低。這一結論充分說明蛋白質是維持啤酒泡沫穩定性的重要因素，而糖類和多酚等物質能在一定程度上對其產生影響。

2.5.2 總糖含量和泡持值的相關性分析

對啤酒原液和泡沫生成液中的總糖含量與啤酒泡持值分別進行相關性分析和偏相關性分析，結果見表3。

表3 不同組間總糖含量和泡持值的相關性及偏相關性分析

注：相關分析采用pearson相關分析，*p<0.05。

可以看出，啤酒原液中和泡沫中糖類含量與啤酒泡持性的相關系數差別不大，對啤酒原液中的數據進行分析，啤酒原液中的總糖含量與啤酒泡持性的相關系數為0.594(p<0.05)，說明在完整的啤酒中總糖含量與泡持性之間存在較為明顯的正相關；偏相關性分析顯示，控制變量蛋白濃度和總多酚含量后，總糖含量與泡持性之間的偏相關系數為-0.289，相關性可以忽略。這說明當啤酒體系中存在蛋白、多酚等組分時，糖類對提高泡持性有積極的作用；而當不存在蛋白、多酚等組分時，單純的糖類對泡持性的貢獻幾乎可以忽略。

這個結論充分證明，糖類的存在對啤酒泡持性起著重要的輔助作用。糖類主要是通過以下幾個方面輔助蛋白質以提高泡沫穩定性：一方面，糖類可以提高整個體系的黏度，使更多的蛋白質富集到泡沫中，而本研究分析結果顯示，泡沫中的蛋白質含量與啤酒泡持性存在較強的正相關，因此，糖類通過幫助蛋白質富集進一步協助提高了啤酒的泡持性[22]；另一方面糖類與蛋白質之間的共價連接，可以改善蛋白質的泡沫性質，從而提高泡沫穩定性[23]。

2.5.3 總多酚含量和泡持值的相關性分析

對啤酒原液和泡沫生成液中的總多酚含量與啤酒泡持值分別進行相關性分析和偏相關性分析，結果如表4所示。

表4 不同組間多酚含量和泡持值的相關性及偏相關性分析

注：相關分析采用pearson相關分析。

啤酒原液中和泡沫中糖類含量與啤酒泡持性的相關系數差別不大，同樣以啤酒原液中多酚與泡持值的相關性進行分析，結果顯示：啤酒原液中的總多酚含量與啤酒泡持性的相關系數為0.365，表明啤酒中總多酚含量與泡持性之間存在微弱的正相關；偏相關性分析顯示，控制變量蛋白濃度和總糖含量后，總多酚含量與泡持性之間的偏相關系數為-0.122，相關性可以忽略。即在整個啤酒體系中，多酚與泡持性之間存在微弱的正相關，對提高啤酒泡沫穩定性有較輕的積極作用，而當體系中不存在蛋白質和糖類等其他組分時，多酚對于泡沫穩定性沒有影響。分析認為這主要是因為多酚能夠通過與蛋白質交聯，改變蛋白質的疏水性和表面張力進而改善泡沫穩定性，而單純的多酚不具有維持泡沫穩定的能力。而另一方面，由于多酚能與蛋白質結合形成沉淀，使啤酒中蛋白質含量降低進而對泡沫穩定性產生不利影響[24]，因此多酚對于啤酒泡沫的影響仍需要進一步探究。

3 結論

對啤酒泡沫生成液、原液、殘液中的主要組分含量進行測定，結果顯示蛋白質在啤酒泡沫中有非常明顯的富集，泡沫生成液中蛋白質質量濃度比啤酒殘液中高27～74 μg/mL，比啤酒原液中高16～58 μg/mL；而糖類和多酚在泡沫中沒有明顯的富集。相關性分析顯示，啤酒中蛋白質、總糖、總多酚含量與泡持值的相關性系數分別為0.875、0.594和0.365；而偏相關性分析顯示，啤酒中蛋白質、總糖、總多酚含量與泡持值的相關性系數分別為0.821、-0.289和-0.122。兩項結果結合分析表明，蛋白質是維持啤酒泡沫穩定性的重要因素；糖類能夠通過提高啤酒體系黏度以協助蛋白質富集到泡沫中，與蛋白質進行共價結合等方式從側面對啤酒泡持有積極作用；多酚可能與蛋白質交聯進而提高泡沫穩定性，但其影響較小。啤酒中的組分十分復雜，對啤酒泡沫穩定性的研究除了集中于對蛋白質的研究外，其他組分尤其是糖類與蛋白質之間的相互作用，仍然值得進行更深入的研究。

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Analysisonenrichmentofmaincomponentsofbeerinbeerfoamanditseffectonfoamretention

TIAN Jin-feng1,2,WANG Jin-jing1,2,ZHENG Fei-yun1,2,LI Yong-xian1,2, LIU Chun-feng1,2,NIU Cheng-tuo1,2,LI Qi1,2*

1(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China) 2(School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

The beer foam and residue liquid were separated and collected. Then the contents of proteins, total saccharide and total polyphenol and beer foam retention were detected. The results showed that proteins were enriched in beer foam and protein content in beer foam was much higher than that in original beer, but saccharide and polyphenol were not enriched in beer foam. The correlation and partial correlation between beer components and foam retention were also analyzed. The results suggested that there was a strong positive correlation between protein contents and foam retention. Saccharide was able to increase the viscosity of beer and conjugate with proteins to form stable beer foam. Polyphenols might be cross-linked with proteins to improve foam stability, but the impact of polyhenol was smaller than that of saccharide.

foam retention; proteins; total saccharide; enrichment; correlation

碩士研究生(李崎教授為通訊作者，E-mail：liqi@jiangnan.edu.cn)。

國家自然科學基金(No.31571942 & No.31601558)；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目(PAPD)；江蘇省自然科學基金(BK20150159)

2017-02-21，改回日期：2017-05-02

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014103