花鰻鱺AQP3基因的分子特征及其應對鹽度變化的表達規律

王 丹，李多琳，梁奮飛，曹全全，尹紹武

花鰻鱺AQP3基因的分子特征及其應對鹽度變化的表達規律

王 丹，李多琳，梁奮飛，曹全全，尹紹武

（南京師范大學生命科學學院，江蘇省生物多樣性與生物技術重點實驗室，南京 210023）

為了探究花鰻鱺（Anguila marmorata）AQP3基因在不同鹽度下的表達規律，利用RACE技術克隆了花鰻鱺AQP3基因cDNA全長序列，并進行了生物信息學分析；通過實時熒光定量PCR（RT－qPCR），檢測了花鰻鱺AQP3在9個組織中的分布及鹽度脅迫后鰓、腎、腸組織在0、6、12、24 h和3、5、10 d的表達情況。結果顯示：花鰻鱺AQP3基因的cDNA全長為1299 bp，開放閱讀框 （ORF）為891 bp，5’非編碼區 （UTR）和3’非編碼區（UTR）分別為60 bp和348 bp，共編碼296個氨基酸，具有6段跨膜結構域及2個NPA（天冬氨酸－脯氨酸－丙氨酸）保守結構域。氨基酸多重序列比對結果顯示，花鰻鱺AQP3基因與其同屬的歐洲鰻鱺（Anguilla anguilla）、日本鰻鱺 （Anguilla japonica）同源性分別高達97.0%和96.0%。RT－qPCR檢測發現，AQP3基因在鰓組織中表達量最高，而在脾臟中表達量最低；在咸淡水（鹽度10）和海水（鹽度25）組中，鰓組織的AQP3基因表達水平呈下降趨勢，且在各時段均顯著下調；腎組織的AQP3表達水平在咸淡水（除24 h外）和海水（除6 h外）組中也顯著下調；腸組織的AQP3表達水平在咸淡水組中顯著上調，而在海水組中則顯著下調。研究表明，花鰻鱺AQP3的mRNA表達量在應對不同鹽度環境時呈現不同的表達變化模式，這將為深入揭示花鰻鱺適應鹽度變化的分子調控機理奠定理論基礎。

花鰻鱺；AQP3；鹽度；mRNA表達量

魚類生活在復雜的水環境中，鹽度脅迫會嚴重威脅著魚類自身的內穩態，進而影響魚類的分布、洄游、生長、發育和繁殖等［1］。滲透調節機制是魚類應對鹽度脅迫最直接的反應，在此過程中，魚類需要調節內部環境與周圍水生環境之間的離子、水分子的轉運。水通道蛋白被視作細胞中真正的“管道系統”，水分子的高效轉運是通過細胞膜上的水通道蛋白實現的［2－5］。AQP3是水通道蛋白家族中一類特殊的水甘油通道蛋白，它不僅能夠轉運水分子，還能轉運甘油這樣的小分子溶質［6］。不僅如此，AQP3在抗利尿激素的調節、cAMP及皮質醇的調節、腫瘤發育等方面也發揮著重要作用［7－10］。

花鰻鱺 （Anguila marmorata），隸屬于鰻鱺目（Anguilliformes），鰻鱺科（Anguillidae），鰻鱺屬，是降海洄游性魚類，為我國國家II級保護野生動物?；狑~是珍貴的食用魚類之一，其肉質鮮美，是鰻鱺屬魚類中營養價值最高的品種，優于同屬的日本鰻鱺（Anguilla japonica）及歐洲鰻鱺（Anguilla anguilla）［11］。目前，鹽度脅迫與魚類滲透調節機制的相關研究大多集中在細胞（α氯細胞、β氯細胞）、激素（生長激素、胰島素、皮質醇等）、酶（Na＋／K＋-ATP酶）以及離子通道（鈉鉀泵、囊性纖維化跨膜傳導調節因子）等方面。AQP3作為一類特殊的水甘油通道蛋白，其在魚類滲透調節中的作用日益受到重視：如 KIM等［12］成功在日本鰻鱺中克隆出了AQP3，研究發現，在淡水和海水中，AQP3在腦、食道、胃、脾、腸、腎、鰓中均表達。DAWOON等［13］探討了大西洋鳉（Fundulus heteroditus）由淡水轉入海水1 d后，AQP3在鰓中的表達水平，結果顯示，其AQP3的mRNA表達量顯著下降。ENGELUND等［14］對大西洋鮭 （Salmo salar）的研究表明，AQP3在腎組織中集中分布在腎臟近端小管上皮細胞頂端并沿著上皮細胞延伸。對紅大馬哈魚（Oncorhynchus nerka）的研究發現，AQP3在鰓中的表達量遠遠高于AQP8，而AQP8在腸中表達量卻遠高于AQP3［15］。為了探究花鰻鱺AQP3基因在不同鹽度下的表達規律，本研究運用RT-qPCR技術檢測了AQP3在花鰻鱺9種不同組織（腦、鰓、腎、腸、肝、心、肌肉、鰾和脾）中的分布，同時檢測了花鰻鱺在不同鹽度（淡水、咸淡水和海水）、不同時間段 （0、6、12、24 h和3、5、10 d）下，AQP3在3種滲透調節組織（鰓、腎和腸）中的表達變化，以期為進一步解析花鰻鱺滲透調節的分子機制提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

花鰻鱺幼鰻平均體長 （23.30±2.97）cm，平均體質量 （21.17±2.29）g，取自中國海南文昌金山花鰻鱺科技有限公司。暫養于玻璃循環缸中1月，每日10∶00投喂飼料，攝食30 min后虹吸排污。每日換1／3水體。實驗開始前1 d停止進食。實驗用水為曝氣24 h的自來水，養殖水溫保持在25～27°C。試驗組中的咸淡水（鹽度10）和海水（鹽度25）由曝氣后的自來水與海水晶按相應比例配制而成。

1.2 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

根據北京百泰克公司的高純總RNA快速抽提試劑盒（離心柱型）提取花鰻鱺組織總RNA，用分光光度計檢測 RNA濃度、A260／A280值及A260／A230值檢測RNA質量，用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。所有樣品凍存于－80°C冰箱中備用。以總RNA為模板，根據HiScriptTM1ST strand cDNA Synthesis kit（南京諾唯贊生物科技有限公司）的說明書進行反轉錄，獲得cDNA第一條鏈。

1.3 花鰻鱺AQP3基因RACE全長克隆

從花鰻鱺轉錄組測序的cDNA文庫中篩選得到1078 bp的AQP3基因的cDNA中間EST序列，PCR驗證 EST序列，并做 5’RACE（美國Invitrogen公司的System for Rapid Amplification of cDNA Ends Version 2.0試劑盒）獲得花鰻鱺AQP3基因的5’端序列，3’RACE（美國 Clontech公司的SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒）獲得AQP3基因的3’端序列。所需引物見表1。

1.4 花鰻鱺AQP3基因的生物信息學分析

利用在線軟件 BLAST（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）驗證花鰻鱺 AQP3基因序列。利用在線軟件 ORF finder（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／gorf／orfig.cgi）尋找序列中的開放閱讀框。利用軟件Clustal X進行序列比對分析。利用DNAman軟件進行序列翻譯。利用MEGA 5.0軟件構建Neighbor-Joining系統發生樹。利用在線軟件 ExPASy（http：／／web.expasy.org／protparam）分析理化性質。利用在線軟件SMART（http：／／smart.embl-heidelberg.de／）預測跨膜區域。利用在線軟件SOPMA預測蛋白二級結構。利 用 在 線 軟 件 Predictprotein （http：／／www.predictprotein.org／）搜索蛋白結構域及 motif。利用NCBI服務器上的在線分析工具CDART（Conserved Domain Architecture Retrieval Tool）檢測氨基酸序列。

表1 花鰻鱺AQP3基因克隆、RACE及熒光定量的引物Tab.1 Primers used for A.marmorata AQP3 cDNA cloning，RACE and qRT-PCR

1.5 花鰻鱺AQP3基因的組織表達分析

從淡水對照組中隨機取3 ind花鰻鱺幼鰻，提取9個組織（鰓、腎、腸、肝、腦、脾、鰾、心和肌肉）的總RNA，反轉錄獲得cDNA第一鏈。根據花鰻鱺及其近緣物種的AQP3序列分別設計特異性引物AQP3-F、AQP3-R，以及作為內參基因的花鰻鱺actin基因特異性上下游引物actin7、actin8（表1）。以獲得的9個組織的cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR，分別檢測花鰻鱺AQP3在9個組織中的表達情況。PCR反應體系為20 μL：Faststart Universal SYBR Green Master 10μL，正反引物 （2μmol·μL－1）各 3μL，cDNA模板（5 ng·L－1）4μL。反應程序：95°C預變性 5 min；94°C 30 s，55°C 30 s，72°C 1 min，35個循環；72°C延伸5 min。于4°C保存。

1.6 不同鹽度、不同時段下花鰻鱺AQP3基因的表達分析

為進一步探究不同鹽度、不同時段下，花鰻鱺AQP3基因在滲透調節相關組織（鰓、腎、腸）中表達變化規律，將實驗所用的幼鰻分為淡水組（對照組）和2個試驗組：咸淡水組（鹽度10）、海水組（鹽度25）。實驗前，先將兩個試驗組的幼鰻置于淡水環境，隨后，每天升高3鹽度，直至成為咸淡水和海水。分別在0、6、12、24 h和3、5、10 d時，從每組中隨機取3 ind幼鰻的鰓、腎、腸組織，實驗重復3次（n＝9），用液氮冷卻10 min，隨后于－80°C保存。提取總RNA，檢測AQP3基因的相對表達量。

1.7 數據處理

采用 2-△△CT法進行數據處理［16］，△CT ＝Ct target（花鰻鱺 AQP3基因）－Ct actin（花鰻鱺actin基因）；△△CT＝△CT試驗組－△CT對照組（0小時）。利用統計學軟件SPSS 23對計算得到的數據進行單因子方差分析 （one-way ANOVA）。若 P＜0.05，則顯著差異；P＜0.01，則極顯著差異。所有數據采用均值±標準差（Means±SD）表示。

2 結果與分析

2.1 花鰻鱺AQP3基因的序列分析

通過RACE技術克隆得到AQP3基因的cDNA全長序列1 299 bp，其中ORF為891 bp，5’端UTR為60 bp，3’端UTR為348 bp，共編碼296個氨基酸（圖1）。

ExPASy軟件預測，AQP3基因的相對分子質量 （molecular weight）為32.22 kDa，理論等電點（theoretical isoelectric point）為6.89，總的平均親水系 數 （grand average of hydropathicity，GRAVY）為0.546。SMART軟件對AQP3氨基酸序列分析發現了6段跨膜結構域（圖2），跨膜位點：26－48、58－80、101－123、157－179、192－214和 247－269。CDART（conserved domain architecture retrieval tool）對花鰻鱺AQP3基因的氨基酸序列檢測，發現兩個NPA（天冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸）保守結構域。經Predictprotein軟件預測，花鰻鱺AQP3基因含有1個蛋白激酶C磷酸化位點、1個酪蛋白激酶II磷酸化位點、1個焦激肽位點、8個N-?；稽c、1個MIP超家族特征位點、4個N糖基化位點、3個O糖基化位點且序列中的5個半胱氨酸未形成二硫鍵。利用SOPMA軟件對花鰻鱺AQP3蛋白二級結構分析，發現二級結構中α螺旋、β轉角、延伸鏈及無規則卷曲分別占序列全長的45.27%、7.43%、22.64%和 24.66%。

2.2 花鰻鱺AQP3基因的氨基酸序列同源性及系統進化分析

利用Clustalx 2軟件，將花鰻鱺AQP3氨基酸序列與歐洲鰻鱺、日本鰻鱺、大西洋鮭等進行對比分析和同源性檢測。結果顯示，花鰻鱺AQP3氨基酸序列與9種已知物種的AQP3氨基酸序列同源性很高，為69% ～97%（圖3）。其中，與同屬的歐洲鰻鱺、日本鰻鱺同源性最高，分別為97%、96%。

圖2 花鰻鱺AQP3蛋白質跨膜區域Fig.2 Transmembrane graphics of AQP3 protein of A.marmorata

基于AQP3氨基酸序列，利用MEGA 5.0軟件構建Neighbor-Joining系統發生樹（圖4）。結果顯示，所有魚類聚集為一支，所有兩棲和哺乳類動物聚集為另一支。在魚類分支中，花鰻鱺、歐洲鰻鱺和日本鰻鱺聚集成一支，這與三者之間極高的同源性是一致的。

2.3 花鰻鱺AQP3基因在淡水中的組織表達分布

RT-qPCR結果顯示（圖5），花鰻鱺AQP3基因在9個組織中均有表達。其中，花鰻鱺AQP3基因在鰓組織中表達量最低，而在脾臟中表達量最高。

圖3 脊椎動物AQP3氨基酸序列多重比對Fig.3 Multiple sequences alignment of AQP3 amino acid in vertevrates

圖4 脊椎動物AQP3 NJ發生樹Fig.4 Neighbor joining phylogenetic tree based on AQP3 amiono acid sequences of vertebrates

圖5 淡水對照組中花鰻鱺AQP3在不同組織中的相對表達量Fig.5 Relative expression of A.marmorata AQP3 in different tissues in fresh water

2.4 不同鹽度、不同時段下花鰻鱺AQP3基因的表達分布

在咸淡水（鹽度10）、海水（鹽度25）組中，花鰻鱺鰓組織的AQP3的mRNA在各時段中均顯著下調。其中，咸淡水組在6 h時表達量最低，僅為淡水對照組的21.0%，在12 h及隨后時段中，AQP3的表達量相對穩定，但仍明顯低于淡水組；海水組在3、5、10 d時表達量相對較低，僅為淡水對照組的6% ～7%。（圖6）。

圖6 鹽度10和鹽度25下花鰻鱺鰓組織中AQP3 mRNA的表達Fig.6 Temporal expression profiles of A.marmorata AQP3 mRNA in gill under 10 ppt and 25 ppt by using RT-qPCR

在腎組織中，咸淡水組中AQP3的表達量在各時段均顯著下調（除24 h外）。其中，在12 h時咸淡水組中的表達量降至最低，在24 h時表達量上調至淡水對照水平，在3、5、10 d時表達量再次顯著降低。海水組中AQP3的表達量在各時段也顯著下調（除6 h外）。在6 h時海水組表達量上調至淡水組的2.5倍，隨后表達量顯著降低，在12 h時表達量降至最低，僅為淡水組的14%，在12 h及隨后時段表達量持續較低（圖7）。

圖7 鹽度10和鹽度25下花鰻鱺腎組織中AQP3 mRNA的表達趨勢Fig.7 Temporal expression profiles of A.marmorata AQP3 mRNA in kidney under 10 ppt and 25 ppt by using RT-qPCR

在腸組織中，咸淡水、海水組的表達量均先在6 h時上調，隨后咸淡水組中AQP3表達量顯著上調，而海水組中AQP3表達量顯著下調。咸淡水組中AQP3表達量在6 h時顯著上調，在12 h下調至淡水對照水平，隨后在24 h和3、5 d表達量再次上調，且在3 d時表達量達到最大值為淡水組的2.5倍，在10 d時表達量再次下調至淡水對照水平。海水組的AQP3表達量在6 h時上調，在12 h時表達量下調，在12 h及隨后時段表達量均處于較低水平，且在5 d時表達量最低。（圖 8）。

3 討論

花鰻鱺AQP3基因的全長克隆及氨基酸序列分析表明，6段跨膜結構域及2個NPA（天冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸）保守結構域是水通道蛋白家族典型的序列特征［17－19］，其在 141～143位點丟失的N糖基化位點與鰻鱺屬其它魚類的研究結果一致［20］，這進一步證明了AQP3在結構和功能上的保守性。脊椎動物氨基酸序列多重比對結果與構建的NJ系統發生樹結果是一致的，比對發現花鰻鱺AQP3與同屬的歐洲鰻鱺、日本鰻鱺的同源性分別高達97%和96%，在系統發生樹中三者也在魚類分支上聚集一支，這不僅證明了AQP3在鰻鱺屬中的高度同源性，還為揭示花鰻鱺在系統進化中的地位提供了可靠依據。

花鰻鱺AQP3基因在鰓中表達量最高，其次為肌肉和腸，而在腎中的表達量卻較低。無論是在淡水環境還是咸水環境，鰓、腎、腸組織都是魚類應對鹽度脅迫、維持滲透平衡的重要組織［21］。在本研究中，AQP3在鰓、腸組織中表達量較高，這與KIM等［12］對日本鰻鱺的研究是一致的。同時，魚類的鰓相當于哺乳動物的呼吸道，MATSUZAKI等［22］對哺乳動物的AQP3表達分布研究表明，在哺乳動物中，AQP3廣泛分布于一些與外界環境接觸的組織中，如眼、呼吸道、消化道、尿道、皮膚等組織?；狑~AQP3在肌肉中具有較高的表達量可能與肌肉的儲水功能有關。腎作為花鰻鱺的重要滲透調節組織之一，其表達量卻相對較低，推測可能與魚類腎臟排泄低滲尿的性質有關［23］。

AQP3位于鰓組織的氯細胞基底膜側，與Na＋、K＋-ATP酶共處［24－25］。本研究表明，在鰓組織中，花鰻鱺AQP3基因在咸淡水（鹽度10）和海水（鹽度25）組中的表達量均顯著下調。此結果與DAWOON等［13］對大西洋鳉的研究是一致的，將大西洋鳉由淡水轉入海水1 d后，AQP3在鰓中的表達水平顯著降低。MACIVER等［26］對歐洲鰻鱺的研究、CUTLER等［27］對日本鰻鱺的研究結果同樣表明，在鹽度脅迫下，鰓組織中AQP3的mRNA表達量顯著降低。由此表明，在鰓組織中，鹽度脅迫廣泛影響鰓組織中AQP3的表達。在滲透調節過程中，花鰻鱺鰓組織的AQP3扮演著重要作用。

在腎臟中，咸淡水（除24 h外）、海水組（除了6 h外）的AQP3的表達水平均顯著下調。甘遠迪等［28］利用RT-qPCR檢測了AQP3在薩羅羅非魚 （Sarotherodon melanothern）、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）腎臟中的表達，研究發現海水組表達水平明顯低于淡水組。本研究結果與甘遠迪等［28］對薩羅羅非魚、尼羅羅非魚的研究結果是一致的。但是，TIPSMARK等［29］對大西洋鮭的研究卻發現，將大西洋鮭由淡水轉移到海水24 h后，其腎臟中AQP3的表達量卻上漲10倍，并且在隨后兩周也維持在較高水平。推測在鹽度脅迫下，不同物種腎臟中AQP3的表達模式具有差異。DANZLER等［30］研究表明，大西洋鮭腎組織中AQP3表達量的升高可能與腎臟的保水功能有關。在此過程中，花鰻鱺AQP3表達量下調的原因有待進一步研究。

本研究表明，在咸淡水組中，花鰻鱺腸組織的AQP3表達水平明顯高于淡水組；而海水組中表達水平則明顯降低。本研究結果與CHOIET等［31］對紅大馬哈魚的研究結果是一致的。CHOIET等［31］研究表明，在低鹽度海水組中，幼鮭（parr stage salmon）AQP3的表達水平顯著上升，在高鹽度海水組中，幼鮭及二齡幼鮭 （smolt stage salmon）AQP3的表達水平均顯著下降。當鰻鱺屬魚類腸液滲透壓低于血液滲透壓時，便會通過腸道吸水，彌補內外環境滲透壓差引起的失水［32－34］。筆者推測，咸淡水組中 AQP3表達量上調可能與此有關。不同于咸淡水組，海水組中AQP3表達水平顯著下降。由此表明，鹽度不同，花鰻鱺腸組織中AQP3功能可能有所差異。但是，KIM等［12］對日本鰻鱺的研究結果卻與之不同。KIM等［12］研究結果顯示，AQP3在海水組直腸中的表達水平遠高于淡水組。由此表明，AQP3在不同物種的腸組織中具有不同的表達模式。在6 h時，咸淡水、海水組中AQP3表達水平均顯著上調，表明在咸淡水、海水組中，AQP3在早期可能都參與了吸水。

AQP3是位于細胞膜上的重要水通道蛋白之一［12，34－36］。本研究發現，在不同鹽度、不同時段下，花鰻鱺鰓、腎、腸組織的AQP3呈現不同的表達變化模式，并且在各時段中，AQP3基因的表達水平均呈顯著差異?？梢?，AQP3在花鰻鱺滲透調節過程中扮演了重要角色。

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Cloning and effects of different salinities on aquaporin 3（AQP3）in juvenile marbled eel，Anguilla marmorata

WANG Dan，LI Duo-lin，LIANG Fen-fei，CAO Quan-quan，YIN Shao-wu
（Jiangsu Province Key Laboratory for Biodiversity and Biotechnology，College of Life Sciences，Nanjing Normal University，Nanjing 210023）

In order to successfully adapt to threats of salinities，fish possesses AQPs（aquaporin）which are essential for water transport in the process of osmoregulation and maintaining homeostasis.AQP3 is unique in that it can not only transport water，but also participate in glycerin，urea and other small nitrogen-containing molecule transport activities.The method of RACE was applied to clone the DNA sequence of AQP3 from Anguila marmorata and then bioinformatics analysis was carried on for the purpose of investigating the role of AQP3 in A.marmorata osmotic adjustment process.The technique of real-time qRCR was adopted to detect mRNA expression in the blank tissues（including brain，gill，intestine，kidney，liver，muscle，heart，spleen and swim bladder）of fish acclimated to fresh water（0 ppt）.The same batch of A.marmorata was acclimated to two other salinity gradients：brackish water（10 ppt）and sea water（25 ppt），to observe expression changing patterns at different time（0 h，6 h，12 h，24 h，3 d，5 d and 10 d）in three osmoregulation associated tissues（including gill，kidney and intestine）.The results showed that the full length of A.marmorata AQP3 cDNA was 1 299 bp，containing an 891 bp open reading frame，with a 60 bp 5’untranslated region（UTR）and 348 bp 3’UTR.It encoded 296 amino acids，owning a six transmembrane structure and two NPA（aspartic acid-proline-alanine）conserved domains.The multiple amino acid sequence comparison showed that AQP3 of A.marmorata shared the highest identity with European eel（Anguila anguila，97%）and Japanese eel（Anguila japonica，96%）.The higher expression was detected in gill，with the highest expression，intestine and muscle，yet an extremely low expression was observed in spleen，with the lowest expression，kidney，liver and other tissues.AQP3 mRNA expression level in the gill decreased significantly at all time of the experiment when exposed to brackish water（10 ppt）and sea water（25 ppt）.In the kidney，the mRNA expression significantly decreased except for 24 h in brackish water and 6 h in sea water.In the intestine，the mRNA expression was upregulated in the brackish water group，while the expression in the sea water group was downregulated.The experimental results suggested that AQP3 of A.marmorata may involve in the osmoregulation activity and present different expression changing patterns under different salinity gradients.These findings might contribute a lot to reveal the molecular mechanism of A.marmorata under different salinity gradients.

Anguila marmorata；AQP3；salinity；mRNA expression

S 917.4

A

1004－2490（2017）05－0518－11

2016－12－21

江蘇省自然科學基金項目（BK20141450）

王 丹（1993－），女，江蘇人，碩士研究生，主要從事魚類生理與遺傳育種研究。E-mail：wangdan1612＠163.com

尹紹武，教授，博士生導師。Tel：025－85891840，E-mail：yinshaowu＠163.com