青藏高原霍爾巴綿羊線粒體基因組研究

袁亞莉

（甘肅省隴西縣畜牧獸醫技術服務中心，隴西 748100）

青藏高原霍爾巴綿羊線粒體基因組研究

袁亞莉

（甘肅省隴西縣畜牧獸醫技術服務中心，隴西 748100）

利用重測序方法對青藏高原霍爾巴綿羊線粒體基因組進行測序、組裝，并對基因特點和系統發育進行分析。結果表明：霍爾巴綿羊線粒體基因組全長16 621 bp，該基因由13個蛋白編碼基因、22個轉運RNA基因、2個核糖體RNA基因和1個非編碼控制區組成；基因特點顯示堿基A含量33.64%、T含量27.32%、C含量25.90%、G含量13.14%，A+T含量（61.96%）比G+C含量（39.04%）高，表現出一定的堿基偏好，轉換多于顛換，表現較高的轉換偏向；基于線粒體基因組構建了22個不同物種的NJ樹，表明霍爾巴綿羊與綿羊屬親緣關系最近，與牛屬和巖羊屬親緣關系最遠。

霍爾巴綿羊；基因組；線粒體；系統進化

霍爾巴綿羊是在青藏高原惡劣氣候和特殊生境條件下，經過長期自然選擇、閉鎖繁育，特別是近十多年的定向系統選育而形成的高原型肉毛兼用藏系綿羊地方類群，中心產區位于西藏自治區日喀則市仲巴縣霍爾巴鄉，目前存欄大約5萬只，平均活重35.50 kg，胴體重23.45 kg，剪毛量 2.00 kg，毛長 14.50 cm［1］。

高等動物線粒體是共價閉合的環狀雙鏈DNA分子，具有較高的突變率和母系遺傳特征，特別適合種內、種間及種以上分類階元的進化研究［2］。鞏元芳等［3］用mtDNA基因研究了中國幾個地方綿羊品種線粒體多態性，表明我國地方綿羊品種的起源可能是單一的。管松等［4］研究了中國西南地區5個地方綿羊群體mtDNA遺傳多樣性，得出西藏綿羊有3個母系來源，云南綿羊有2個母系來源。因此，mtDNA基因可以作為一種遺傳標記，用來研究綿羊的起源進化以及親緣關系。本研究以霍爾巴綿羊為素材，測定了其線粒體基因組序列，并進行對比分析，以期為霍爾巴綿羊的起源分化及遺傳親緣關系的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

霍爾巴綿羊血液采自西藏藏族自治區日喀則市仲巴縣霍爾巴鄉扎次村（北緯 30°10′47″、東經 83°10′09″，海拔4 468 m），所采全血樣為6 mL，EDTA抗凝，-20℃凍存。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 霍爾巴綿羊血液基因組總DNA的提取按照天根生物有限公司動物組織DNA提取試劑盒說明書操作。

1.2.2 引物設計與線粒體DNA基因片段的擴增 用DNAMAN進行比對，查出保守序列，利用primer 5設計引物，根據目的基因、pGM-T載體的特點，設計兩端含有限制性內切酶EcoRⅠ酶切位點的引物。

PCR擴增反應體系：霍爾巴綿羊DNA樣品1 μL（75 ng/μL），10×Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L 的 dNTP 2 μL，25 mmol/L MgCl21μL，正向引物和反向引物（10 μmol/L）各 1 μL，Taq DNA 聚合酶 0.3 μL（5 U/μL），加滅菌雙蒸水至25 μL。未加DNA樣品為陰性對照。反應程序：94℃，2 min 預變性；94℃、60 s，44℃、60 s，72℃、90 s，35個循環；最后72℃延伸5 min。擴增產物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果。

1.2.3 純化與測序 用北京百泰克生物技術有限公司回收試劑盒進行純化與回收，將mtDNA的PCR純化產物與pGM-T連接并轉化感受態DH5a，進行藍白斑鑒定，篩選陽性克隆，并命名為PGM-T-mtDNA。對陽性克隆進行PCR和EcoR I酶切鑒定，對鑒定正確的質粒送由上海生工進行測序。

1.2.4 序列分析和系統發育樹的構建 運用ClustalX軟件將測得序列進行比對，輔以人工校正。利用MEGA 5.1軟件對霍爾巴綿羊mtDNA基因序列進行種內和種間差異評估［5-6］，用鄰接（neighbour-joining，NJ）法構建系統發育樹，系統發育樹各分支的置信度由1 000次自舉法（bootstrap）檢驗。

2 結果與分析

2.1 mtDNA的組成及其變異特點

霍爾巴綿羊線粒體基因組的組成和注釋詳見表1和圖1?；魻柊途d羊線粒體基因組全長16 621 bp，該基因由13個蛋白編碼基因、22個轉運RNA基因、2個核糖體RNA基因和1個非編碼控制區組成；基因特點顯示A含量33.64%、T含量27.32%、C含量25.90%、G含量13.14%，霍爾巴綿羊線粒體基因組的組成和其他哺乳動物的組成是相似的［7-8］。A+T含量（61.96%）比G+C含量（39.04%）高，表現出一定的堿基偏好，轉換多于顛換，表現較高的轉換偏向。13個蛋白編碼基因全長為11 402 bp，占整個線粒體基因組全長的68.60%；霍爾巴綿羊與大多數哺乳動物一樣，線粒體基因組的編碼除了ND6和8個轉運RNA基因是從輕鏈開始編碼之外，其余都是從重鏈開始編碼的；13個蛋白編碼基因的起始密碼子除了ND2、ND3和ND5是ATA之外，其余的起始密碼子都是ATG；5個蛋白編碼基因（ND1，ND2，COX3，ND3 和 ND4）的終止密碼子是一個不完整的終止密碼子T（aa），然而細胞色素b基因（Cytb）的終止密碼子由AGA變為TAA，其余7個蛋白編碼基因的終止密碼子是典型的TAA。線粒體基因組控制區（D-Loop）位于tRNA-Phe和tRNA-Pro之間，全長為1 183 bp（從15 439 bp到16 621 bp），12S rRNA基因的全長為959 bp（從69 bp到1 027 bp），16S rRNA基因的全長為 1 576 bp（從 1 095到 2 670 bp）；22 tRNA基因的長度在60 bp到75 bp之間變化。

表1 霍爾巴綿羊線粒體基因組注釋

續表1

圖1 霍爾巴綿羊線粒體基因組注釋

2.2 霍爾巴綿羊系統發育樹的構建

利用本實驗測定的霍爾巴綿羊線粒體基因組序列以及從GenBank數據庫下載的21個不同物種的線粒體基因組序列，通過MEGA 5.1軟件基于Kimura兩參數距離采用鄰位相接法（NJ），構建22個不同品種的系統發育樹（見圖2）。結果表明，霍爾巴綿羊與綿羊屬親緣關系最近，與牛屬和巖羊屬親緣關系最遠，這與Hu等［9］、Lancioni等［8］和 Zhong 等［11］的研究結果一致。

圖2 基于線粒體基因組序列構建的22個不同物種的NJ樹

3 結論

本研究對霍爾巴綿羊線粒體基因組進行克隆測序，對其基因組成和序列變異特點進行注釋和分析，初步構建了25個不同物種的系統進化樹，研究結果表明，霍爾巴綿羊屬于一個獨立的地方綿羊品種。這為剖析霍爾巴綿羊線粒體基因組的遺傳特點和品種起源、分化及親緣關系提供了理論依據。

［1］洛桑催成.仲巴縣霍爾巴綿羊種質資源調查［J］.中獸醫學雜志，2015，159（9）：166-167.

［2］Meyer A，Kocher T D，Basasibwaki P，et al，Monophyletic origin of Lake Victoria cichild fishes suggested by mitochondrial DNA sequences［J］.Nature，1990，347：550-553.

［3］鞏元芳，李祥龍，劉錚鑄，等.幾個地方綿羊品種線粒體DNA（mtDNA）細胞色素 b 基因多態性研究［J］.中國獸醫學報，2006，26（2）：213-215.

［4］管松，何曉紅，浦亞斌.中國西南地區5個地方綿羊群體mtDNA遺傳多樣性及系統進化研究［J］.畜牧獸醫學報，2007，38（3）：219-224.

［5］Thompson J D，Higgins D G，Gibson T J.ClustalW：improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting，position-specific gap penalties and weight matrix choice［J］.Nucleic Acids Res，1994，22：4673-4680.

［6］Tamura K，Dudley J，Nei M，et al.MEGA5.1：Molecular Evolutionary Genetics Analysis（MEGA）software version 4.0［J］.Molecular Biology and Evolution，2007，24：1596-1599.

［7］Zhao E，Yu Q，Zhang N，et al.Mitochondrial DNA diversity and the origin of Chinese indigenous sheep［J］.Tropical Animal Health and Production，2013，45：1715-22.

［8］Hahn C，Bachmann L，Chevreux B.Reconstucting mitochondrial genomes directly from genomic next-generation sequencing readsa baitingand iterative mapping approach［J］.Nucleic Acids Research，2013，41：e129.

［9］Hu X D，Gao L Z.The complete mitochondrial genome of domestic sheep，Ovis aries［J］.Mitochondrial DNA，2016，27（2）：1425-1427.

［10］Lancioni H，Di Lorenzo P，Ceccobelli S，et al.Phylogenetic relationships of three Italian Merino-Derived sheep breeds evaluated through a complete mitogenome analysis［J］.PLoSOne，2013，8（9）：e73712.

［11］ZhongT，Han J L，GuoJ，et al.Genetic diversity of Chinese indigenous sheep breeds inferred from microsatellite markers［J］.Small Ruminant Research，2010，90：88-94.

The Complete Mitochondrial Genome Sequence of Huoerba Sheep in the Qinghai-Tibetan Plateau

Yuan Yali
（Technology Service Center of Animal Husbandry and Veterinary of Longxi County，Longxi 748100，Gansu，China）

Huoerba sheep，as a year-round grazing animal in the Qinghai-Tibetan plateau of China，is an excellent local breed and plays a vital role in promoting the economy development and livelihoods for native herders.In current study，gene resequencing of the complete mitochondrial genome sequence of Huoerba sheep was conducted for the first time，and the characteristics and phylogeny of the gene were analyzed.The results showed that the total length of the mitogenome was 16 618 bp which consisted of 13 protein-coding genes，22 transfer RNA（tRNA）genes，2 ribosomal RNA（rRNA）genes and 1 non-coding control region（D-loop region）.The characteristics of overall base composition were：A（33.64%），T（27.32%），C（25.90%），G（13.14%），A+T（61.96%）and G+C（39.04%）.The genes in which the transitions were more than transversions showed a certain base preference and higher biased gene conversion.The analyses of phylogenetic relationships based on the construction of the mitochondrial genomes of 22 different species of Neighbor-Joining tree indicated that Huoerba sheep had the closest genetic relationship with sheep but the most distant relationship was observed with Bos and Pseudois.This study provides useful data for further study on protection ofgenetic resources and the taxonomy of Caprinae.

Huoerba sheep；genome；mitochondrion；phylogenetic

S826.2

A

2095-3887（2017）06-0005-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.06.002

2017-08-02

袁亞莉（1976－），女，畜牧師，主要從事畜牧技術推廣服務工作。