嬰幼兒食品生產環境中陰溝腸桿菌的分離鑒定及其PFGE溯源分析

林學海,林文珍,陳遠哲,黃聰輝,王偉軍,肖功年

(1.浙江科技學院生物與化學工程學院,浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室,杭州 310023;2.浙江熊貓乳業集團股份有限公司,溫州 325800;3.浙江一鳴食品股份有限公司,溫州 325499)

嬰幼兒食品生產環境中陰溝腸桿菌的分離鑒定及其PFGE溯源分析

林學海1,林文珍2,陳遠哲1,黃聰輝1,王偉軍3,肖功年1

(1.浙江科技學院生物與化學工程學院,浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室,杭州 310023;2.浙江熊貓乳業集團股份有限公司,溫州 325800;3.浙江一鳴食品股份有限公司,溫州 325499)

通過對嬰幼兒食品生產環境中可能存在的陰溝腸桿菌污染點進行取樣,共分離得到了30株菌株,16S rRNA鑒定結果表明有15株為陰溝腸桿菌,在檢出菌株中占50%,且分布較為廣泛,在成品區域檢出率高達80%.同時,利用脈沖場凝膠電泳(PFGE)分型技術對15株陰溝腸桿菌進行了溯源分析,發現生產環境可能成為陰溝腸桿菌二次污染源,原料樣品中污染的陰溝腸桿菌經過一系列工序加工后,仍然存在于后續半成品或成品中.

陰溝腸桿菌;嬰幼兒食品;PFGE分型技術

0 引言

陰溝腸桿菌[1](Enterobacter cloacae,ECL)是革蘭氏陰性桿菌,屬腸桿菌科腸桿菌屬細菌,由于該菌普遍存在于人和動物的腸道中,可引起敗血癥、呼吸道感染、尿道感染和腹膜炎等疾病,也能引起食源性疾病,因此常常被當作條件致病菌的代表.2004年4月,聯合國糧農組織和世界衛生組織建議將其代替大腸菌群作為評價嬰兒配方奶粉安全性的衛生指標[2].

脈沖場凝膠電泳(Pulse-Field Gel Electrophoresis,PFGE)是一種細菌分子分型技術,以電場作為引導力,對利用稀有切點的限制性核酸內切酶進行酶切產生大小不同的DNA片段進行分離[3].PFGE分型技術可鑒別菌株間的親源性,分析各菌樣的流行相關性,追溯污染源,從污染途徑或污染源對污染微生物進行控制,被認為是微生物分子分型技術的quot;金標準quot;[4].

1 實驗

1.1 材料與設備

材料:腸道菌增菌肉湯(EE肉湯),胰蛋白胨大豆瓊脂培養基(TSA),細菌基因組DNA提取試劑盒,蛋白酶K,Xba I酶.

儀器:全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(VITEK?2-Compact),VITEK革蘭陰性鑒定卡,9700 PCR擴增儀,DYY-10C型電泳儀,BIO-RAD Gel Doc XR+凝膠成像系統,HC-2062高速離心機,DKZ-1電熱恒溫振蕩水槽,ATB比濁器,Fe20k型pH計,水平電泳槽,垂直電泳槽,SHP-150生化培養箱.

1.2 方法

1.2.1 取樣與菌種鑒定

根據嬰幼兒食品生產流程,對可能存在的微生物污染點進行涂抹取樣,將得到的樣品參照《乳及乳制品衛生微生物學檢驗方法第7部分:陰溝腸桿菌檢驗》(SN/T 2552.7)進行培養和篩選[5],挑選疑似菌落進行生理生化鑒定.將初步鑒定的菌株利用16S核酸全序列檢測技術以鑒定其所屬及種,再進行相關實驗.

1.2.2 PFGE實驗

陰溝腸桿菌PFGE分型方法主要參考美國PulseNet PFGE標準化分型方法[6],對分離得到的陰溝腸桿菌進行PFGE分型實驗,具體步驟如下:

(1)制膠.將實驗用菌株接種到TSA上,37℃過夜培養,將菌苔轉移至有細胞懸浮液(CSB)的Falcon管中,調節OD值為4.0~4.5,取制成的菌懸液400 μL轉移至1.5 mL離心管中,每管加入20 μL質量濃度為20 mg/mL的蛋白酶K混勻,使其最終質量濃度為0.5 mg/mL.加入55℃預熱的含1%Seakem Gold:1%SDS的低熔點瓊脂糖400 μL,混勻加入模具加樣孔中,室溫下凝固15 min.

(2)膠塊裂解.在50 mL聚丙烯螺帽管中加入:5 mL細胞裂解液(CLB)和20 mL蛋白酶K.將膠塊移入相應管中,做好標記,放入54℃水浴搖床中,水浴4 h,轉速60 r/min(不宜過快).用去離子水(DDH2O)清洗4次,10~15 min/次,再用TE緩沖液清洗2次,10~15 min/次.

(3)膠塊內DNA酶切.用刀片切下2~2.5 mm寬的膠塊,放入含酶切稀釋液的1.5 mL微量離心管中,37℃水浴中孵育5-10 min,或室溫10~15 min.將膠塊轉入含10 U/μL Xba I酶的酶切體系中,37℃水浴中酶切至少2 h.

(4)電泳.將酶切后的膠塊置于梳齒上,從膠槽的下部中央緩慢到入熔化的經55~60℃平衡的1%SKG,在室溫下凝固30 min左右,記錄加樣順序.將凝固的膠塊加入盛有2.2 L 0.5X TBE緩沖溶液的電泳槽中,開始電泳.電泳條件:14℃、分子量30~700 ku,脈沖時間2.16~63.8 s,電泳時間18~19 h.

(5)拍照和結果分析.電泳結束后,取出膠,放在盛放400 mL的Gelred溶液托盤內,染色20~30 min.以500 mL純水脫色每20~30 min換1次DDH2O,脫色4次.用BIO-RAD Gel Doc XR+凝膠成像系統拍攝圖像.

1.2.3 PFGE條帶分析

利用Quantity one TM軟件提取PFGE圖譜,電泳圖譜用沙門菌H9812作為統一的分子量標準進行校準,用BioNumerics V6.6軟件(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean,UPGMA)方法進行聚類分析.

2 結果與分析

2.1 取樣與菌種鑒定

根據SN/T 2552.7[5]取樣方法,對嬰幼兒食品生產環境中可能存在的污染點取樣,分離得到了30株菌株,經16S rRNA鑒定得到的結果,如表1所示.

表1 生產車間微生物分離鑒定結果

從嬰幼兒食品生產環境中分離鑒定出的30株菌株(表1),經過16S rRNA鑒定,這些菌分屬于10個種,其中7個種均分屬于腸桿菌科,分別為陰溝腸桿菌、粘質沙雷氏菌、非脫羧勒克菌、弗氏檸檬酸桿菌、無色桿菌、霍氏腸桿菌和赫氏埃希氏菌,而其中主要檢出菌為陰溝腸桿菌,共檢測出了15株,在檢出菌株中占50%.

由表1可以看出,陰溝腸桿菌分布較為廣泛,在原料區域、生產區域和成品區域均有檢出,在成品區域檢出率最高,結果高達80%.嬰幼兒食品生產過程中由于外界因素如人、原料以及環境等都會帶入微生物進而污染產品.

取樣方法以SN/T 2552.7為標準,將得到的微生物進行16S rRNA鑒定,鑒定結果大部分為腸桿菌科,未檢測出阪崎克羅諾桿菌.一方面說明阪崎克羅諾桿菌在生產過程中較少,對于最終產品生產較為有利;另一方面腸桿菌科較多說明食品生產環境中微生物控制還需要加強.

2.2 PFGE分型溯源分析

將分離鑒定的15株陰溝腸桿菌利用PFGE分型技術進行溯源分析,陰溝腸桿菌基因組DNA片段得到良好分離,產生15~26條DNA片段,酶切條帶分子量范圍為20~1 200 kb,其中主要酶切條帶集中在30~700 kb,見圖1.

圖1 陰溝腸桿菌聚類分析圖譜

聚類圖使用非加權配對算數平均法UPGMA構建,條帶位置差異容許度和優化度分別設為1.00和0.50.以數值為相關性大小判定,規定將相似度≥50%者歸為同一型別PFGE基因指紋圖譜,相似度≥70%者歸為同亞型PFGE基因指紋圖譜,相似度≥99%者歸為同一菌株PFGE基因指紋圖譜.

根據分析結果可確認2和3菌株與其他陰溝腸桿菌屬于不同型別PFGE基因圖譜,說明菌株間相關性不大,是不同型別的陰溝腸桿菌.

菌株6,7,8相似性為84%;菌株10,11,12相似性為76%;菌株13,14,15,16相似性為87%;表明這三組菌株各分屬于不同陰溝腸桿菌菌株,即每組內菌株為同一壓型菌株.從樣品來源結合菌株PFGE基因圖譜分析,菌株6,7,8分別來源于畚斗、大米車間傳送帶擋板和包裝機表面;這些地方可能是二次污染的污染源,需要在生產過程中注意進行清潔處理.菌株10,11,12分別來源于魚肉高蛋白粉大包料表面、干燥之后半成品和米粉半成品1,可判斷該米粉半成品污染源可能為外來原料或生產環境.菌株13,14,15,16分別來源于大米原料、米粉后混機、米粉半成品2和米粉成品1,菌株間相似性高達87%,可判斷此4株陰溝腸桿菌為同一菌株,污染途徑為從大米原料開始,隨著米粉混料工藝和后混工序,最后污染米粉產品,大米原料為產品污染的污染源.

3 討論

陰溝腸桿菌由于其普遍性和危害性而一直受到人們的關注,有調查發現[7],陰溝腸桿菌在奶粉中的檢出率高達21.3%,且分離出了與侵襲性大腸桿菌相同抗原的陰溝腸桿菌.此次分離與鑒定結果顯示,在嬰幼兒食品生產環境中雖未發現阪崎克羅諾桿菌,但陰溝腸桿菌污染情況較為嚴重,在原料區域、生產區域和成品區域均有檢出,因此對于陰溝腸桿菌的檢測和控制具有重要的實際意義.

起初,阪崎克羅諾桿菌被誤認為是陰溝腸桿菌的生物變型菌,并被命為quot;黃色陰溝腸桿菌(yellow-pigmented Enterobacter cloacae)quot;,直到1980年,Farmer等[8]對收集的57株阪崎克羅諾桿菌進行DNA雜交、生化反應、黃色菌落產物以及抗生素敏感性等一系列實驗,結果發現quot;黃色陰溝腸桿菌quot;與陰溝腸桿菌雖在生化反應上相似,但quot;黃色陰溝腸桿菌quot;在培養2-7 d左右D-山梨醇反應為陰性,胞外DNA酶反應陽性,并且產生黃色菌落、對氨芐青霉素和頭孢菌素非常敏感,這些都與陰溝腸桿菌不同,為此Farmer等建議將quot;yellow-pig?mented Enterobacter cloacaequot;更名為quot;Enterobacter sakaza?kiiquot;.此名稱被廣泛地采納,并沿用至今.

目前國內針對陰溝腸桿菌的研究報道并不多,主要集中在其耐藥基因、耐藥機制和臨床分布方面[9,10],對陰溝腸桿菌在嬰幼兒食品分離鑒定和溯源分析方面未見新的報道.采用傳統的檢測方法雖能滿足檢測的需求,但難以體現出菌樣本身的代表性,不能準確推測出其在生產環境中的流行相關性,此外,傳統檢測方法往往會出現假陽性和假陰性的現象.林學海等[11]報道指出PFGE分型技術作為食品生產過程中快速檢測與監測技術,可分析菌樣間的親源性和流行相關性,從而追溯污染源,實現在此基礎上采取適當措施控制污染源.此次對于陰溝腸桿菌PFGE溯源分析可發現生產環境可能成為二次污染的污染源,原料中的陰溝腸桿菌經過一些列生產工藝后依然存在于后續半成品或成品中,成為生產污染源,分析結果表明PFGE分型技術能夠分析菌株之間的遺傳差異和相關性.Masaki等[12]以PFGE分型技術證實了用來清洗玻璃瓶的刷子被克羅諾桿菌感染后,成為了3例病例的感染來源.柴云雷等[13]對分離自不同來源的10株阪崎克羅諾桿菌分別進行16S rDNA全序列檢測和PFGE分型分析,發現PFGE的分型分析能力明顯優于16S rDNA全序列檢測.對生產過程中可能存在的微生物污染點進行取樣檢測,通過PFGE分型技術,及時監測污染源或污染點,分析樣品間可能存在的聯系,針對性采取恰當措施,進而避免微生物爆發式污染產品;同時也可用于對已確認的爆發污染進行污染源或者污染途徑溯源追蹤,從而有效預防微生物污染的再次發生.

4 結論

(1)從嬰幼兒食品生產環境中分離鑒定了30株菌株,其中15株為陰溝腸桿菌,在檢出菌株中占50%,且分布較為廣泛,在成品區域檢測率高達80%,結果表明,雖未檢測出阪崎克羅諾桿菌,但陰溝腸桿菌污染情況較為嚴重.

(2)對15株陰溝腸桿菌利用PFGE分型技術進行溯源分析,發現生產環境可能成為陰溝腸桿菌二次污染源,原料中的陰溝腸桿菌經過一些列工藝后依然存在于半成品或成品中,成為生產污染源.

[1]顧怡明,張杰,俞云松,等.多重耐藥陰溝腸桿菌流行狀況及耐藥機制的研究[J].中華醫院感染學雜志.2004,14(12):1321-1324.

[2]DRUDY D,MULLANE N R,QUINN T,et al.Enterobacter sakaza?kii:An Emerging Pathogen in Powdered Infant Formula[J].Clinical Infectious Diseases.2006,42(7):996-1002.

[3]OLIVE D M,BEAN P.Principles and applications of methods for DNA-based typing of microbial organisms[J].Journal of Clinical Mi?crobiology.1999,37(6):1661-1669.

[4]SWAMINATHAN B,BARRETT T J,HUNTER S B,et al.PulseNet:the molecular subtyping network for foodborne bacterial disease surveillance,united states[J].Emerging Infectious Diseases.2001,7(3):382-389.

[5]SN/T 2552.7-2010乳及乳制品衛生微生物學檢驗方法第7部分:陰溝腸桿菌檢驗[S].2010.

[6]Centers for Disease Control and Prevention.Standardized laboratory protocol for molecular subtyping of Escherichia coli O157:H7,non-ty?phoidal Salmonella serotypes,and Shigella sonnei by Pulsed Field Gel Electrophoresis(PFGE)[EB/OL].[2009-06-17]http://www.cdc.gov/pulsenet/protocols/ecoli-salmonella-shigella-protocols.pdf.

[7]MUYTJENS H L,ROELOFS W H,JASPAR G H.Quality of pow?dered substitutes for breast milk with regard to members of the family Enterobacteriaceae[J].JournalofClinicalMicrobiology.1988,26(4):743-746.

[8]Farmer J J I,ASBURY M A,HICKMAN F W,et al.Enterobacter saka?zakii:a new species of Enterobacteriaceae isolated from clinical speci?mens.[J].International Journal of Systematicamp;Evolutionary Microbiol?ogy,1980,30(3):569-584.

[9]MOKRACKA J,KOCZURA R,PAWLOWSKI K,et al.Resistance patterns and integron cassette arrays of Enterobacter cloacae complex strains of human origin[J].Journal of Medical Microbiology.2011,60(6):737-743.

[10]張衛軍.一起由陰溝腸桿菌引起的食物中毒的實驗室檢測分析[J].中國衛生檢驗雜志.2010(2):425-426.

[11]林學海,龔金炎,王偉軍,等.克羅諾桿菌生物學特性及其嬰幼兒食品中控制措施研究進展[J].中國乳品工業.2016,44(8):37-42.

[12]MASAKI H,ASOH N,TAO M,et al.Detection of gram-negative bacteria in patients and hospital environment at a room in geriatric wards under the infection control against MRSA[J].Kansenshogaku Zasshi the Journal of the Japanese Association for Infectious Diseases.2001,75(2):144-1450.

[13]柴云雷,滿朝新,盧雁,等.PFGE與16S rDNA對阪崎克羅諾桿菌分型的研究[J].中國乳品工業.2014,42(10):11-14.

Strain identification and PFGE tracing analysis of Enterobacter cloacae in the environment of infant food production

LIN Xuehai1,LIN Wenzhen2,CHEN Yuanzhe1,HUANG Conghui1,WANG Weijun3,XIAO Gongnian1
(1.School of Biological and Chemical Engineering,Zhejiang provincial Key Lab for Chemamp;Bio Processing Technolo?gy of Farm produces,Zhejiang University of Science and Technology,Hangzhou 310023,China;2.Zhejiang Panda Dairy Co.Ltd.,Wenzhou 325800,China;3.Zhejiang Yiming Food Co.,Ltd,Wenzhou 325499,China)

This paper samples the possible contamination of Enterobacter cloacae in the environment of infant food production.As a result,30 strains were isolated and 15 strains were identified to be Enterobacter cloacae by the technology of 16S rRNA which were accounted for 50 per?cent in the quantity of isolated of 30 strains.Moreover,the distribution of strains of Enterobacter cloacae are extensive,the isolated-rate even up to 80 percent in the finished product area.Simultaneously,15 strains of Enterobacter cloacae were analyzed by pulsed-field gel electrophoresis(PFGE),it was concluded that the production environment may become secondary sources,and the contaminated raw material of Enterobacter cloacae will still exists in the follow-up semi-finished or finished products after a series of processing.

Enterobacter cloacae;infant food;PFGE typing technology

Q93-331

A

1001-2230(2017)10-0011-03

2017-02-23

浙江省重大科技專項重大農業項目(2014C02012);浙江省自然科學基金項目(LY14C200007);杭州市科技計劃項目(20140432B106).

林學海(1991-),男,碩士研究生,從事乳品微生物控制研究.

肖功年