云南鯛魚皮酸溶性膠原蛋白的組成及理化特性

姚行行，莊永亮

(昆明理工大學 云南省食品安全研究院，云南 昆明，650500)

云南鯛魚皮酸溶性膠原蛋白的組成及理化特性

姚行行，莊永亮*

(昆明理工大學 云南省食品安全研究院，云南 昆明，650500)

采用低溫酸法提取云南鯛魚皮酸溶性膠原蛋白(ASC)，對ASC的氨基酸組成、亞基組成、結構特征、熱穩定性以及溶解性等理化性質進行了研究，為云南鯛魚皮的綜合利用提供了理論依據。研究表明，ASC的主要氨基酸為甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸，酪氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸含量較低，脯氨酸的羥化率為35.47%；SDS-PAGE電泳圖譜表明ASC主要由α1、α2以及β鏈組成，符合I型膠原蛋白的特征；ASC的最大紫外吸收波長為230 nm；紅外光譜和X-射線圖譜表明ASC分子排列規則緊湊，具有完整的三螺旋結構；差示熱量掃描顯示ASC的熱變性溫度分別為82.1和222.3℃，表明ASC的熱穩定性較好；掃描電鏡顯示ASC分子呈三維的多片狀結構，分布均勻，適合用作食品、藥品和化妝品的載體和生物醫學的基料；在pH值小于4或NaCl濃度低于40 g/L時，ASC具有良好的溶解性。

鯛魚皮；膠原；結構；熱變性溫度；溶解度

膠原蛋白是動物體內含量較為豐富的一類蛋白質，是細胞外基質的結構蛋白，分子結構穩定，具有低免疫原性和良好的生物相容性，廣泛地應用于食品、醫藥、化妝品以及生物醫學等領域。近年來，我國水產養殖業和水產加工業得到了迅猛發展，魚類加工下腳料等副產品的產量也越來越大[1]，據報道，魚類產品加工過程中，產生的下腳料占原料魚總重的40%～55%。目前，這些下腳料未被充分利用。研究表明，魚加工下腳料中，膠原蛋白含量非常豐富，是生產膠原蛋白的潛在來源[2]。云南鯛魚(Oreochromissp.)養殖是云南高原特色的水產產業，云南鯛魚主要加工成生魚片、魚豆腐、魚糜等產品。鯛魚在加工過程中產生了大量的下腳料，主要包括皮、骨、鰭等。本文主要對云南鯛魚皮中的酸溶性膠原蛋白進行了提取純化并評價其理化性質，拓寬了膠原蛋白的加工來源，并為促進云南鯛魚加工下腳料的綜合利用提供理論依據和數據支持。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

云南鯛魚皮由云南海王水產有限公司提供，加工現場收集，加冰保存帶回實驗室，-20℃儲存備用。蛋白標品(Marker)，大連寶生物工程有限公司(Takara)；透析袋，武漢市蓋云天生物技術有限公司(biosharp)；胰蛋白酶(4 000 U/g)，上海源葉生物科技有限公司。試劑均為分析純。

1.2主要儀器與設備

L-8900氨基酸分析儀，日本日立公司；DYCZ-25E型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；5700型傅立葉紅外光譜儀，美國尼高力儀器公司；TU-1901紫外可見光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；DSC 214 Polyma型差示掃描量熱儀，德國耐馳公司；Empyrean型X射線衍射儀，荷蘭帕納科公司；Hitachi S-4800型電子顯微鏡，日本日立公司。

1.3魚皮膠原蛋白的提取

魚皮膠原的提取采用低溫酸法[1]。向魚皮中加入0.1 mol/L的NaOH[魚皮質量(g)∶NaOH倍液體積(mL)=1∶20，2 d，每隔12 h換液)和體積分數10%正丁醇(魚皮質量(g)∶正丁醇(mL)=1∶20，2 d，每隔1 d換液]除去雜蛋白和脂肪，然后加入0.5 mol/L乙酸[魚皮質量(g)∶乙酸液體積(mL)=1∶40，3 d〗提取膠原蛋白，離心(4 ℃；10 000 g，1 h)，上清液用0.9 mol/L NaCl進行鹽析，離心(4 ℃；10 000 g，15 min)，沉淀用0.5 mol/L乙酸復溶，轉入透析袋對去離子水透析2 d，冷凍干燥制備鯛魚皮酸溶性膠原蛋白(acid soluble collagen，ASC)。

1.4氨基酸組成分析

稱取一定ASC樣品于水解管中，按1∶60(g∶mL)的比例加入6 mol/L HCl溶液，110 ℃條件下水解22 h。用氨基酸分析儀對ASC的氨基酸組成進行分析。

1.5SDS-PAGE

ASC的電泳方法參考文獻[3]并稍作修改。取一定量的ASC樣品于0.02 mol/L磷酸緩沖液中(1% SDS，3.5 mol/L 尿素，pH 7.2)，100 ℃加熱使其溶解(5 min)，離心，上清液以體積比4∶1的比例與電泳緩沖液(4% SDS，0.5 mol/L Tris-HCl，20%甘油，含或不含10% β-巰基乙醇，pH 6.8)混合，用SDS-PAGE對ASC的亞基組成進行分析，電泳中分離膠和濃縮膠濃度分別為10%和5%。

1.6傅里葉變換紅外光譜(FTIR)

取一定量的ASC樣品與KBr混合碾磨(質量比=1∶200)，壓片后用傅立葉紅外光譜儀記錄ASC在400～4 000 cm-1范圍內的紅外吸收特征。

1.7紫外光譜吸收(UV)

取一定量的ASC樣品于0.5 mol/L乙酸中，配制成3 g/L的膠原溶液，進行紫外光譜掃描，0.5 mol/L的乙酸溶液為對照，波長190～400 nm。

1.8差示掃描量熱法(DSC)

以空坩堝作為對照，測定ASC在0～250 ℃的DSC圖譜，升溫速率為10 ℃/min。

1.9X-射線衍射(X-ray)

采用X-射線衍射儀記錄ASC在5～40°(2θ)衍射圖譜。線源為Cu靶Ka輻射(λ=0.154 nm)，掃描速度4°/min，電壓和電流分別為40 kV和40 mA。

1.10微觀結構分析

采用電子掃描顯微鏡觀察ASC的微觀結構，選用放大倍數分別為200×，500×和2 000×。

1.11溶解性測定

1.11.1 pH值對ASC溶解度的影響

取20 mL ASC溶液(3 g/L)于離心管中，用6 mol/L HCl或6 mol/L NaOH調節pH值為1～10，用蒸餾水(已調至與溶液pH一致)補齊到30 mL，振蕩30 min，離心(13 000 g，20 min)，采用雙縮脲法測定計算上清液蛋白質含量。

1.11.2 NaCl濃度對ASC溶解度的影響

取15 mL ASC溶液(6 g/L)于離心管中，等體積加入NaCl溶液使溶液鹽離子的最終濃度分別為0、1、2、3、4、5、6 g/L，振蕩 30 min，離心(13 000 g，20 min)，采用雙縮脲法測定計算上清液蛋白質含量。

1.12數據統計

用Origin 8.5版本進行數據處理以及作圖，數據表達為(平均值±標準偏差)。

2 結果與討論

2.1氨基酸組成

ASC的氨基酸組成如表1所示。ASC的甘氨酸為主要氨基酸(159.49 mg/g)，符合膠原蛋白的特征；丙氨酸和谷氨酸的含量也較高，分別為72.93和69.34 mg/g。此外，ASC中甲硫氨酸、異亮氨酸、酪氨酸以及組氨酸的含量較低，半胱氨酸未檢出。羥脯氨酸是膠原蛋白的特征性氨基酸，它參與膠原內部氫鍵的形成，其含量與膠原的變性溫度呈正相關[4]。ASC中脯氨酸和羥脯氨酸的含量分別為82.79和60.60 mg/g，脯氨酸的羥化率為35.47%，與三文魚[5]、虹鱒魚[4]以及鱈魚[5]等魚皮膠原的結果相似，具有冷水魚膠原蛋白的氨基酸組成特點。

表1 鯛魚皮膠原蛋白的氨基酸組成 單位：mg/g

2.2SDS-PAGE分析

云南鯛魚皮膠原蛋白的電泳圖譜如圖1所示。ASC主要由α1鏈、α2鏈以及β鏈組成。α1鏈含量較高，約為α2鏈含量的2倍；α1鏈中可能還含有α3鏈，因為α1鏈和α3鏈在SDS-PAGE膠上無法分離[6]。在α鏈的上方是β鏈，分子質量約為200 kDa，它是膠原多肽鏈通過共價交聯作用形成的二聚體，此外，ASC的電泳圖中還檢測到少量的γ鏈。β-巰基乙醇的添加對ASC電泳結果并無影響，說明ASC中不含二硫鍵，這與氨基酸分析中膠原不含半胱氨酸的結果相吻合。ASC的電泳圖譜特征表明，ASC屬于I型膠原蛋白。

A-蛋白Marker；B-添加了β-巰基乙醇的ASC；C-沒有添加β-巰基乙醇的ASC圖1 鯛魚皮膠原蛋白的 SDS-PAGE 電泳圖譜Fig.1 SDS-PAGE patterns of ASC of Yunnan bream

2.3UV分析

圖2 鯛魚皮膠原蛋白的紫外掃描圖譜Fig.2 UV-Vis spectra of ASC of Yunnan bream

2.4FTIR分析

紅外光譜是研究蛋白質構象的常用方法。膠原蛋白的紅外光譜通常含有5個特征吸收峰，即酰胺A、B及Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ帶。酰胺A帶歸屬于N—H基團的伸縮振動，其吸收峰通常位于3 400～3 440 cm-1，當它與氫鍵締合程度較高時，其吸收頻率會發生藍移[7]。ASC的酰胺A帶位于3 440 cm-1(圖3和表2)，沒有發生藍移現象，這說明ASC分子N—H基團與氫鍵締合程度較低。酰胺B帶的吸收峰位于2 950 cm-1，它是CH2基團的不對稱伸縮振動產生的。

圖3 鯛魚皮膠原蛋白的紅外光譜圖Fig.3 Fourier transforms infrared spectra (FTIR) of ASC of Yunnan bream

表2 鯛魚皮膠原蛋白主要特征峰位置極其歸屬

2.5X-ray分析

X-射線衍射是研究膠原蛋白內部結構的重要方法之一。如圖4所示ASC有3個衍射峰，與先前研究的胡子鯰魚皮膠原蛋白的衍射圖譜相似[11]。已知X-射線的波長(λ=154 nm)和θ角，根據布拉格方程2dsinθ=λ計算各個衍射峰對應的d值，計算結果見表3。

圖4 鯛魚皮膠原蛋白的X射線衍射圖譜Fig.4 X-ray diffraction diagrams of ASC Yunnan bream

表3 膠原蛋白X射線衍射峰對應d值

ASC的峰1出現在7.66°處，峰型尖銳。峰1的d值代表了膠原纖維分子鏈間的距離[12]，計算得(表3)ASC峰1的d值為0.15 nm，略小于先前報道的羅非魚皮和魚鱗膠原蛋白的d值[12]，說明ASC分子間的距離較小，排列規則緊密。峰2是一個寬且大的饅頭峰，出現在19.11°處，該峰反映了膠原蛋白內部復雜結構層次所引起的漫散射；峰3峰型較小，出現在31.16°處，峰3的d值可反映膠原螺旋中心軸上相鄰兩個氨基酸殘基間的距離。根據文獻描述[13]，在膠原蛋白的三螺旋結構中，螺旋中心軸上相鄰氨基酸殘基間的距離為0.29 nm，這與ASC峰3的d值一致。以上結果表明，低溫酸法提取后的鯛魚皮膠原蛋白仍然較好的保持了其原有的結構。

2.6DSC分析

DSC是一種通過測定樣品熱焓變化來研究物質結構變化的熱分析技術，廣泛應用于蛋白質的熱變性研究領域。ASC的DSC圖譜如圖5所示。

圖5 鯛魚皮膠原蛋白的DSC圖譜Fig.5 DSC thermogram of ASC of Yunnan bream

ASC在0～250℃共有2個熱吸收峰(峰1和峰2)。第一個吸收峰的變性溫度為82.1℃(T1)，它是膠原三螺旋結構的降解以及水分子的釋放引起的[14]；第二個峰的變性溫度為222.3℃(T2)，它是膠原蛋白交聯部分結構改變、蛋白質結構完全破壞時的熔融溫度[14]。鯛魚皮膠原蛋白的熱變性溫度略高于北梭魚膠原的熱變性溫度(T1=80.1℃，T2=203.1℃)[15]，表明ASC具有較好的穩定性。膠原的熱變性溫度主要與膠原的水分含量，氨基酸組成，提取方法以及棲息地溫度有關[15]。

2.7微觀結構分析

膠原蛋白的顯微結構是膠原工業應用重要參數。ASC放大200×、500×以及2 000×后的電鏡掃描如圖6所示。在低倍鏡下(200×和500×)，ASC呈三維立體的多層狀空間結構，由片狀的膠原纖維相互交聯而成，分布規則且均勻；在高倍鏡下(2 000×)，ASC呈薄膜狀，表面光滑且質密，無褶皺和折疊現象。ASC的微觀結構特點與先前報道的銀鰭鮫鯊的微觀結構相似[16]，適合用作食品、藥品、化妝品和保健品的載體以及生物醫學材料的基料。

a-200×；b-500×；c-2000×圖6 鯛魚皮膠原蛋白的掃描電鏡圖像Fig.6 Scanning electron microscopic images of ASC of Yunnan bream

2.8溶解性分析

2.8.1 pH值對膠原溶解度的影響

ASC在pH 1～10條件下的相對溶解度如圖7所示。在酸性范圍內，ASC的溶解度較大，在pH 4時達到最大值；繼續增大溶液的pH值，膠原的溶解度劇烈下降，在pH 7時ASC的溶解度最低，總體呈現先升高后下降再略有回升的趨勢。膠原蛋白的溶解性與其等電點密切相關。在等電點附近，膠原靜電荷為零，蛋白相互聚集而沉降，因而溶解度較??；偏離等電點，膠原靜電荷增大，分子間分散性較好，因而溶解度較大[17]。

圖7 pH值對膠原溶解度的影響Fig.7 The effects of pH on the solubility of ASC of Yunnan bream

2.8.2 NaCl濃度對膠原溶解度的影響

圖8表示ASC在不同NaCl濃度下的溶解度變化。ASC在NaCl濃度為0～4%時有較好的溶解性；當鹽離子濃度大于4%后，ASC的溶解性隨離子強度濃度的增大而明顯下降。蛋白質的溶解性的變化是鹽溶和鹽析反應共同作用的結果。在低濃度時，鹽離子能與膠原結合，使膠原分子所帶正電荷的增加，分子間相互排斥，穩定了蛋白質的結構，因而溶解度越大；當鹽濃度較高時，鹽離子能與蛋白分子周圍的水分子結合，破壞了蛋白質水化膜，使蛋白質脫水而析出，導致溶解度的降低[18]。

圖8 NaCl濃度對膠原溶解度的影響Fig.8 The effects of NaCl concentrationson the solubility of ASC of Yunnan bream

3 結論

本文對鯛魚皮中的酸溶性膠原蛋白進行了提取，并測定了其理化性質。結果表明，鯛魚皮膠原蛋白為I型膠原蛋白，脯氨酸羥化率為35.47%；紅外光譜和X-射線衍射圖譜表明ASC分子排列緊湊，保持了完整的三螺旋結構；DSC顯示ASC的變性溫度分別為82.1和222.3 ℃，熱穩定性較好；ASC分子呈三維的多片狀結構，分布均勻；在pH值小于4和NaCl濃度低于40 g/L時，ASC的溶解性較好。綜上所述，鯛魚皮是較好的水產類膠原蛋白來源，在功能性食品、化妝品、醫藥、制藥等行業有潛在的商業應用。

[1] 陳明輝, 湯海青, 歐昌榮,等. 鱘魚皮膠原蛋白的理化特性研究[J].現代食品科技, 2015, 31(12): 191-196.

[2] 莊永亮, 侯虎, 林琳. 魚皮魚骨膠原肽制備及生物活性研究[M].北京:科學出版社, 2015:1.

[3] TAMILMOZHI S, VEERURAJ A, ARUMUGAM M. Isolation and characterization of acid and pepsin-solubilized collagen from the skin of sailfish (Istiophorusplatypterus)[J].Food Research International, 2013, 54(2): 1 499-1 505.

[4] 張治國, 肖朝耿,唐宏剛,等. 虹鱒魚皮膠原蛋白提取及其性質研究[J].中國食品學報, 2015, 15(8): 148-154.

[5] ARNESEN J A, GILDBERG A. Extraction and characterisation of gelatin from Atlantic salmon (Salmosalar) skin[J].Bioresource Technology, 2007, 98(1): 53-57.

[6] NALINANON S, BENJAKUL S, KISHIMURA H, et al. Type I collagen from the skin of ornate threadfin bream (Nemipterushexodon): Characteristics and effect of pepsin hydrolysis[J].Food Chemistry, 2011, 125(2): 500-507.

[7] DOYLE B B, BENDIT E G, BLOUT E R. Infrared spectroscopy of collagen and collagen-like polypeptides[J].Biopolymers, 1975, 14(5): 937-957.

[8] 段蕊, 張俊杰, 陳玲,等. 鯉魚魚皮和魚骨酶溶性膠原蛋白的性質比較[J].食品與發酵工業, 2008, 34(5): 10-13.

[9] 葉韜, 林琳, 張曉霞,等. 羅非魚骨膠原蛋白質的提取及其性質[J].食品與生物技術學報, 2015(3): 302-310.

[10] 萬瓊紅, 黨美珠, 曾建成,等. 幾種淡水魚魚鱗酶溶性膠原蛋白的比較研究[J].食品科學, 2009, 30(19): 28-31.

[11] 李八方, 郭鳴, 侯虎,等. 胡子鯰魚皮酸溶性膠原蛋白的理化性質研究[J].現代食品科技, 2013, 29(11): 2 580-2 585.

[12] CHEN JUN-DE, LI LONG, YI RUI-ZAO, et al. Extraction and characterization of acid-soluble collagen from scales and skin of tilapia (Oreochromisniloticus)[J].Food Science and Technology, 2015, 66: 453-459.

[13] EYRE D R. Collagen: molecular diversity in the body's protein scaffold[J].Science, 1980, 207(4437): 1 315.

[14] SIONKOWSKA A, KOZOWSKA J, SKORUPSKA M, et al. Isolation and characterization of collagen from the skin of Bramaaustralis[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2015, 80: 605-609.

[15] KOZLOWSKA J, SIONKOWSKA A, SKOPINSKA-WISNIEWSKA J, et al. Northern pike (Esoxlucius) collagen: Extraction, characterization and Potential application[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2015, 81: 220-227.

[16] JEEVITHAN E, WU Wen-hui, WANG Nan-ping, et al. Isolation, purification and characterization of pepsin soluble collagen isolated from silvertip shark (Carcharhinusalbimarginatus) skeletal and head bone[J].Process Biochemistry, 2014, 49(10): 1 767-1 777.

[17] INWOO B, KIYOSHI O, ASAMI Y, et al. Biochemical properties of acid-soluble collagens extracted from the skins of underutilised fishes[J].Food Chemistry, 2008, 108(1): 49-54.

[18] VEERURAJ A, ARUMUGAM M, BALASUBRAMANIAN T. Isolation and characterization of thermostable collagen from the marine eel-fish (Evenchelysmacrura)[J].Process Biochemistry, 2013, 48(10): 1 592-1 602.

CompositionandphysicochemicalpropertiesofacidicsolublecollagenofYunnanbreamskin

YAO Hang-hang, ZHUANG Yong-liang*

(Yunnan Institute of Food Safety, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China)

The acidic soluble collagen (ASC) from the skin of Yunnan bream was extracted. The amino acids composition, subunit composition, structural characteristics, thermal stability and solubility were investigated. Research showed that ASC was rich in Gly, Pro, Ala, low in Tyr, Met, Cys, and the hydroxylation rate of proline was 35.47%; SDS-PAGE revealed that ASC was mainly composed of α1、α2and β chains, which was in accordance with the structural features of type I collagen. The maximum UV absorption wavelength was at 230 nm; XRD and FTIR showed that the molecule of ASC was closely and regularly arranged and the helical structure was maintained. DSC showed the thermal denaturation temperature of ASC were 86.5 and 226.2℃; SEM showed that ASC was uniformly distributed and had a multi-layered micro structure, which was suitable to be used as a carrier in food, medicine, cosmetics industry and base material in biomedicine. The solubility of ASC was relatively high under acidic (pHlt;4) and low with NaCl concentration (lt;4% (w/v)). This paper provides a theoretical basis for the comprehensive utilization of Yunnan bream skin.

bream skin; collagen; structure; thermal denaturation temperature; solubility

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014288

碩士研究生(莊永亮教授為通訊作者,E-mail：km￣ylzhuang@163.com)。

國家自然科學基金(31360381)

2017-03-13，改回日期：2017-05-22