喹烯酮分子毒性機制研究進展

李道穩 ， 林南昌 ， 王福云 ， 李 斌 ， 肖希龍 ， 湯樹生

(1.中國農業大學動物醫學院 ， 北京 海淀 100193 ； 2.福建省安溪縣動物疫病預防控制中心 ， 福建 安溪 362400)

喹烯酮分子毒性機制研究進展

李道穩1， 林南昌2， 王福云1， 李 斌1， 肖希龍1， 湯樹生1

(1.中國農業大學動物醫學院 ， 北京 海淀 100193 ； 2.福建省安溪縣動物疫病預防控制中心 ， 福建 安溪 362400)

喹烯酮是由中國農業科學院蘭州畜牧獸藥研究所最新研制的抗菌、促生長藥物，其化學名稱為3-甲基-2-苯乙烯酮基-喹噁啉-1,4 -二氧化物，分子式為C18H14N2O3，其化學結構式如圖1所示。淡黃色或黃綠色粉末，不溶于水，略溶于部分有機溶劑，對光敏感[1]。近些年，有關學者重新對喹烯酮的毒性作用進行了研究與評價，發現喹烯酮在體內外均表現出潛在的遺傳毒性，能造成遺傳物質的損傷。彗星試驗和體外胞質分裂阻斷微核試驗檢測喹烯酮對Vero細胞及HepG2細胞內遺傳物質的作用，發現喹烯酮能夠引起細胞DNA和染色體的損傷[2]。最新的研究證明，喹烯酮對BALB/c小鼠也具有遺傳毒性，且與藥物誘導的氧化應激反應有關[3]。劉鳳英證明喹烯酮能誘導細胞S期阻滯，引起和染色體損傷[4]。張朝明證實了喹烯酮能引起肝癌細胞HepG2發生凋亡[1]。本文從喹烯酮誘導氧化應激、細胞凋亡、細胞自噬、內質網應激、炎癥反應、周期阻滯、腎上腺毒性等信號轉導通路來闡述其可能的分子機制，以期為喹烯酮對動物和人的安全性研究及評價提供參考依據。

1 喹烯酮誘導細胞凋亡涉及TNFR1/TNF-α和線粒體凋亡信號通路

喹烯酮能破壞細胞的氧化還原平衡，促使細胞內ROS含量升高，過量的ROS攻擊細胞內的DNA，產生氧化性損傷，導致細胞內DNA氧化損傷標志物8-OHdG含量增加。線粒體和受體介導的凋亡途徑參與喹烯酮誘導的細胞凋亡。喹烯酮促使細胞內p38磷酸化水平升高，誘發TNF-α的合成增加，進而作用于細胞表面高表達的TNFR1受體，通過招募FADD和Caspae-8形成DISC而活化Caspase-8?；罨腃aspase-8剪切Bid蛋白生成tBid，tBid與其他Bcl-2家族蛋白Bax和Bcl-2等共同作用于線粒體，致使線粒體膜通透性增加，引起線粒體膜電位的下降，線粒體功能受損。線粒體膜通透性升高促使線粒體內細胞色素C釋放于胞質，與Caspase-9等共同作用剪切Caspase-3使其活化?；罨腃aspase-3作用于細胞內凋亡相關底物，或作用于PARP酶原使其發生剪切，失去修復DNA損傷的能力，導致細胞凋亡的發生。Caspase-3的活化也可能是活化的Caspase-8直接作用的結果。JNK信號通路可能參與傳遞和放大受體途徑的凋亡信號。受體途徑中可能也有Fas蛋白的參與。p53可能通過調節p21和Bax等蛋白的表達對喹烯酮所致周期阻滯和細胞凋亡進行調節[5]，其作用機制如圖2。

圖1 喹烯酮化學結構式

2 ML-7加強喹烯酮誘導的細胞死亡通過AKT和MAPK介導的凋亡

ML-7是一種抗癌藥，通過對MLCK活性的抑制使得激動蛋白活力降低，從而阻滯了多種癌細胞的增值和遷移。ML-7加強了喹烯酮引起的細胞毒性、內源性和外源性凋亡；ML-7抑制了喹烯酮引起的Akt通路，激發了喹烯酮引起的MAPK家族通路，其中Akt、ERK、JNK起到促生存抑凋亡的作用，而p38 MAPK起到了促凋亡的作用?？偟膩碚f，二者間的相互作用將細胞推向了死亡的方向[6]，其作用機制如圖3。

3 喹烯酮通過ATF6/DAPK1調節mAtg9a運輸引起內質網應激誘導的自噬

喹烯酮能夠引起HepG2細胞中以未折疊蛋白反應(UPR)為代表的內質網應激，并且通過內質網應激誘導自噬水平升高。在內質網應激反應過程中UPR的重要分支ATF6被激活，受ATF6轉錄調控的蛋白DAPK1也同時受到激活。受DAPK1調控的mAtg9的轉運也加強。但當ATF6或DAPK受到抑制時，喹烯酮引起的自噬減少。因此，喹烯酮引起的內質網應激刺激了自噬，并且反應由ATF6和DAPK1介導，并通過mAtg9調控自噬小體的生成[7]，其機制見圖4。

4 姜黃素降低喹烯酮誘導的細胞凋亡和炎癥反應通過激活Nrf2/HO-1通路和抑制NF-kB信號通路

姜黃素(Curcumin)是從姜黃科植物提取的有效成分，抗癌譜廣，毒副作用小，價格低廉，還具有抗炎，抗氧化，抗癌等作用。姜黃素預處理能有效增加喹烯酮誘導L02細胞存活率和降低乳酸脫氫酶的活性，降低喹烯酮誘導的氧化應激、線粒體功能失調和凋亡。姜黃素預處理顯著減少誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)和一氧化氮(NO)合成，下調NF-kB和iNOS mRNA水平，上調Nrf2和HO-1 mRNA水平。HO-1抑制劑(Zinc protoporphyrin IX)顯著降低姜黃素的保護作用通過降低Caspase激活和NF-kB mRNA水平。所以，姜黃素可以有效抑制喹烯酮誘導的凋亡，通過激活Nrf2/HO-1通路，抑制NF-kB通路[8]，其機制如圖5。

5 喹烯酮誘導線粒體凋亡通過ROS依賴性促進VDAC1多聚化和抑制Wnt1/β-catenin通路信號

VDAC1是一個位于線粒體外膜上的蛋白，它在調節能量代謝和細胞凋亡中發揮著重要作用。VDAC1抑制劑可以有效增加喹烯酮誘導的細胞活性和線粒體凋亡，通過減少VDAC1多聚化，降低細胞色素C的釋放和減少Caspase-3、Caspase-9和PARP的剪切。同時，高表達VDAC1增加喹烯酮誘導的VDAC1多聚化和細胞色素C的釋放。此外，Wnt1/β-catenin通路激活劑(LiCl)，顯著降低喹烯酮誘導的線粒體凋亡，通過恢復Wnt1和β-catenin的表達水平。ROS清除劑(NAC)能阻斷喹烯酮誘導的VDAC1的多聚化和抑制Wnt1/β-catenin通路[9], 其機制如圖6。

6 喹烯酮誘導腎上腺毒性機制

喹烯酮(QCT)誘導氧化應激，激活Keap1/Nrf2/ARE, JNK, p38 and ERK1/2通路，增加CYP17A1的表達，降低CYP11B2的表達。喹烯酮通過調控PKC和ERK通路來抑制FOS，結果使CYP17和CYP21活性增加，使CYP11B2和NR4A2活性降低，隨后降低了醛固酮的產生。喹烯酮誘導氧化應激引起JNK和p38 MAPK介導的凋亡，導致BCL2的上調和醛固酮的降低。喹烯酮產生的氧化應激使其下游的Keap1/Nrf2/ARE通路蛋白發生變化，比如下調HMOX1、NQO1、G6PD、SRXN1和TXNRD1。此外，喹烯酮誘導產生ROS通過下調PFKP、NME1、ECH1、ALDH2、G6PD、TPI1、ENO2和上調NOX1來調控Keap1/Nrf2/ARE通路[10]，其機制如圖7。

總結與展望

喹烯酮作為一種新型獸藥，因其良好的抗菌活性和促生長效應被廣泛使用。從喹烯酮無毒副作用，在動物和細胞實驗證明，喹烯酮具有潛在的毒性，對喹烯酮毒性的認識是一個循序漸進的過程。以上綜述的研究表明，喹烯酮可以誘導氧化應激、細胞凋亡、細胞自噬、線粒體自噬、內質網應激、炎癥反應、周期阻滯、腎上腺毒性等多種毒性反應，涉及TNFR1/TNF-α、AKT/MAPK、ATF6/DAPK1、AKT/TSC2/p70S6K、Nrf2/HO-1/NF-kB、Wnt1/β-catenin和Keap1/Nrf2/ARE等多條信號通路，各信號通路之間既相互關聯又相互制約。但喹烯酮作用的靶器官、靶細胞毒性機制的研究尚不明確。近年來研究表明，N→O鍵的斷裂是喹噁啉類藥物的主要代謝途徑，它產生的自由基包括ROS是導致其毒性的主要原因。但喹烯酮的毒性機制及分子作用機理仍有待完善，喹烯酮的毒性不容忽視，其作為飼料添加劑的安全性還有待更多實驗研究進行驗證評判。

[1] 張朝明. 喹烯酮致HepG2細胞毒性與凋亡的分子調控機理研究 [D].北京：中國農業大學，2014.

[2] 陳倩. 喹噁啉類藥物致HepG2細胞氧化損傷及S期阻滯調控機理研究 [D].北京：中國農業大學，2009.

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[4] 劉鳳英，靳溪，湯樹生，等 喹烯酮誘導HepG2細胞DNA復制相關基因表達水平的變化[J]．癌變·畸變·突變，2011，23(5):325-329.

[5] Zhang C, Wang C, Tang S,etal. TNFR1/TNF-α and mitochondria interrelated signaling pathway mediates quinocetone-induced apoptosis in HepG2 cells [J]. Food Chem Toxicol, 2013 Dec;62:825-838.

[6] Zhou Y, Zhang S, Deng S,etal. ML-7 amplifies the quinocetone-induced cell death through akt and MAPK-mediated apoptosis on HepG2 cell line [J].Toxicol Mech Methods, 2016;26(1):11-21.

[7] Zhou Y, Zhang S, Dai C,etal. Quinocetone triggered ER stress-induced autophagy via ATF6/DAPK1-modulated mAtg9a trafficking [J]. Cell Biol Toxicol, 2016 Apr;32(2):141-152.

[8] Dai C, Li B, Zhou Y, Li D,etal. Curcumin attenuates quinocetone induced apoptosis and inflammation via the opposite modulation of Nrf2/HO-1 and NF-kB pathway in human hepatocyte L02 cells [J]. Food Chem Toxicol, 2016 Sep，95:52-63.

[9] Yang X, Tang S, Dai C, Li D,etal. Quinocetone induces mitochondrial apoptosis in HepG2 cells through ROS-dependent promotion of VDAC1 oligomerization and suppression of Wnt1/β-catenin signaling pathway [J]. Food Chem Toxicol, 2017 Mar 23;105:161-176.

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S816.7

A

0529-6005(2017)10-0077-02

2017-05-25

國家自然科學基金(31372486)

李道穩(1990-)，男，博士生，從事獸醫藥理及毒理學研究，E-mail：lidaowen@cau.edu.cn

湯樹生，E-mail：tssfj@cau.edu.cn