疏肝健脾解毒方對乳腺癌癌前病變肝郁證模型大鼠血清性激素水平的影響

李琳霈，楊 曉，潘 博，蔣益蘭*

（1.湖南省中醫藥研究院附屬醫院，湖南 長沙 410006；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

疏肝健脾解毒方對乳腺癌癌前病變肝郁證模型大鼠血清性激素水平的影響

李琳霈1，楊 曉2，潘 博1，蔣益蘭1*

（1.湖南省中醫藥研究院附屬醫院，湖南 長沙 410006；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

目的研究疏肝健脾解毒方對乳腺癌癌前病變肝郁證模型大鼠血清性激素水平的影響。方法采用二甲基苯蒽灌胃及夾尾法制備乳腺癌癌前病變肝郁證大鼠模型，隨機分為模型組、疏肝健脾解毒方組、三苯氧胺組、小金丸組，同時設空白對照組，分別干預4周后采用放射免疫法檢測血清雌二醇、孕酮、泌乳素、黃體生成素和卵泡刺激素含量。結果模型組血清雌二醇、孕酮、泌乳素、黃體生成素和卵泡刺激素水平均較空白對照組高，差異均有顯著統計學意義（P＜0.01）；各用藥組血清性激素水平低于模型組，差異均有顯著統計學意義（P＜0.01）；疏肝健脾解毒方組雌二醇及黃體生成素水平低于對照藥三苯氧胺組及小金丸組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；疏肝健脾解毒方組血清孕酮、卵泡刺激素、泌乳素水平高于三苯氧胺組，低于小金丸組，孕酮水平間差異有統計學意義（P＜0.01），卵泡刺激素、泌乳素水平水平間差異無統計學意義（P＞0.05）。結論疏肝健脾解毒方可有效降低乳腺癌癌前病變肝郁證大鼠模型血清性激素水平。

乳腺癌；癌前病變；疏肝健脾解毒方；性激素

乳腺癌已成為全球范圍內女性最常見的惡性腫瘤[1]，且其發病率仍以3%～4%的速度不斷增長[2]，嚴重威脅著女性身心健康?！笆韪谓∑⒔舛痉健睘槲以褐委熑橄侔┑慕涷灧?，經多年臨床實踐，該方治療乳腺癌及乳腺癌癌前病變患者取得良好療效。為明確其作用機制，本文以乳腺癌癌前病變肝郁證模型大鼠為對象，研究該方對其血清雌二醇（estradiol-2,E2）、孕酮（progesterone,P）、泌乳素（prolactin,PR）、黃體生成素 （luteinizing hormone,LH）和卵泡刺激素（follicle stimulating hormone,FSH）水平的影響?，F將結果報道如下。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級SD雌性大鼠51只，質量(200±20)g，由長沙斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK(湘)2017-0013。于SPF級實驗動物房適應性飼養1周后開始實驗。

1.2 主要儀器

XFS-280型壓力蒸汽滅菌鍋（浙江新豐醫療器械廠）；HHQ-202石蠟切片機 （杭州艾普儀器）；DW-YW226A冰箱 （中科美菱）；CKX41SF型倒置生物顯微鏡 （日本Olympus）；EIX808U全自動酶標儀（美國 BioTek）。

1.3 藥物及試劑

疏肝健脾解毒方由柴胡10 g，郁金10 g，茯苓10 g，白術 10 g，白花蛇舌草 30 g，半枝蓮 30 g，蒲公英30 g組成，由湖南省中醫藥研究院附屬醫院中藥房提供；陽性對照藥三苯氧胺 (枸櫞酸他莫昔芬片)，10 mg/片，購自江蘇揚子江藥業集團有限公司，生產批號：17012811；小金丸：0.6 g/袋，購自四川康特能藥業有限公司，生產批號：170204。二甲基苯蒽(DMBA，Sigma公司）；雌二醇ELISA試劑盒、孕酮ELISA試劑盒、催乳素ELISA試劑盒、卵泡刺激素ELISA試劑盒及黃體生成素ELISA試劑盒均購買于武漢華美生物公司；水合氯醛（上海普振生物股份有限公司）。

2 方法

2.1 受試物制備

受試物疏肝健脾解毒方6劑，用10倍溫水浸泡 0.5 h，大火加熱煎煮，沸騰后繼續煎煮 0.5 h，趁熱過濾。藥渣再加8倍水煎煮2次，每次0.5 h，趁熱過濾。將3次水煎液混合、過濾，減壓濃縮為濃度為1.035 g/mL的溶液備用；三苯氧胺按10 mg:50 mL比例溶于生理鹽水備用；二甲基苯蒽50 g，溶于500 mL芝麻油備用；小金丸用生理鹽水溶散為16 mg/mL的溶液備用。

2.2 造模及分組干預

隨機選取10只SD大鼠為空白對照組，實驗第1天用芝麻油2 mL灌胃1次后自然飼養。乳腺癌癌前病變肝郁證模型制備參考文獻[3]。實驗第1天用溶解有二甲基苯蒽的芝麻油 (l0 mg/mL)，按10 mg/kg比例給大鼠一次性灌胃處理。于第4周開始，限制大鼠活動范圍，用鉗頭纏厚紗布的止血鉗隨機夾大鼠的尾巴，使其保持激怒狀態，尖叫、互相追咬，每天夾尾激惹45 min，連續4周。4周后隨機選取1只大鼠，切取乳腺組織，制備石蠟切片，HE染色，顯微鏡下觀察顯示腺泡或導管上皮增多等增生活躍改變，或腺泡細胞排列紊亂、核漿比增大、核異形性改變等不典型增生改變，提示乳腺癌癌前病變模型造模成功。再按隨機數字表法隨機分為4組，分別為模型組、疏肝健脾解毒方組、三苯氧胺組、小金丸組，每組10只。干預情況如下：疏肝健脾解毒方組、三苯氧胺組及小金丸組分別予以相應藥物溶液灌胃， 劑量分別為 10.35 g/kg、2 mg/kg、0.16 g/kg；空白對照組及模型組均予以等體積蒸餾水灌胃；各組均每天灌胃1次，連續4周。各用藥組給藥劑量均為臨床等效劑量。

2.3 血清性激素水平測定

以10%水合氯醛按3 μL/g劑量腹腔注射麻醉大鼠，股主動脈采血，所采血液以2 000 r/min轉速離心10 min，吸取上清液即血清，合并同組血清，采用放射免疫法檢測E2、P、PR、LH和 FSH含量。

2.4 統計學分析

實驗數據采用SPSS 21.0統計分析軟件進行統計學分析。計量資料以“±s”表示，數據符合正態分布及方差齊性時，兩組間比較采用獨立樣本T檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法；數據不符合正態分布或方差不齊時，則采用非參數檢驗中多個獨立樣本Kruskal-Wallis H檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 動物死亡情況及模型乳腺組織病理觀察

干預過程中，模型組大鼠死亡2只，三苯氧胺組死亡1只，其余各組無大鼠死亡。乳腺癌癌前病變肝郁證模型大鼠乳腺組織病理改變見圖1。

圖1 乳腺癌癌前病變肝郁證模型大鼠乳腺組織病理改變（HE，×200）

3.2 疏肝健脾解毒方對E2、P水平的影響

與空白對照組比較，模型組及各用藥組E2水平均較高，差異有統計學意義（P＜0.01）；各用藥組 E2水平均低于模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）；小金丸組稍高于三苯氧胺組，差異無統計學意義（P＞0.05）；疏肝健脾解毒方組低于三苯氧胺組及小金丸組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。 見表 1。

與空白對照組比較，三苯氧胺組P水平較低，差異有統計學意義（P＜0.05），其余各組 P 水平均高于空白對照組，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；用藥組與模型組比較，P水平較低，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；疏肝健脾解毒方組 P 水平低于小金丸組，高于三苯氧胺組，差異均有顯著統計學意義（P＜0.01）。 見表 1。

表1 疏肝健脾解毒方對 E2、P水平的影響 （±s，n=8，ng/mL）

表1 疏肝健脾解毒方對 E2、P水平的影響 （±s，n=8，ng/mL）

注：與空白對照組比較，*P＜0.01，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與三苯氧胺組比較，◇◇P＜0.01；與小金丸組比較，○○P＜0.01。

組別空白對照組模型組三苯氧胺組小金丸組疏肝健脾解毒方組組E2P 46.62±2.799 65.76±1.982**52.35±1.284**△△53.83±1.309**△△49.42±1.169**△△◇◇○○10.48±0.946 23.13±2.736**8.99±0.564*△△16.99±1.257**△△◇◇14.39±0.582**△△◇◇○○F 139.8 143.0 P 0.000 0.000

3.3 疏肝健脾解毒方對PR、FSH、LH水平的影響

與空白對照組比較，其余各組PR水平均較高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，各用藥組PR水平均較低，差異有顯著統計學意義 （P＜0.01）；三苯氧胺組低于小金丸組，差異無統計學意義（P＞0.05），疏肝健脾解毒方組 PR 水平高于三苯氧胺組，低于小金丸組，差異均無統計學意義（P＞0.05）。 見表 2。

與空白對照組比較，其余各組FSH水平均較高，差異均有顯著統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，各用藥組FSH水平均較低，差異有顯著統計學意義 （P＜0.01）； 小金丸組FSH水平高于三苯氧胺組，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；疏肝健脾解毒方組高于三苯氧胺組，差異有顯著統計學意義（P＜0.01），低于小金丸組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。 見表 2。

與空白對照組比較，疏肝健脾解毒方組LH水平稍低，差異無統計學意義（P＞0.05），其余各組均較空白對照組高，差異均有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，各用藥組LH水平均較低，差異有顯著統計學意義（P＜0.01）；小金丸組 LH 水平稍低于三苯氧胺組，差異無統計學意義（P＞0.05）；疏肝健脾解毒方組低于三苯氧胺組及小金丸組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。 見表 2。

表2 疏肝健脾解毒方對PR、FSH、LH水平的影響 （±s，n=8）

表2 疏肝健脾解毒方對PR、FSH、LH水平的影響 （±s，n=8）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與三苯氧胺組比較，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01；與小金丸組比較，○P＜0.05。

組別空白對照組模型組三苯氧胺組小金丸組疏肝健脾解毒方組組PR/ng·mL-1 26.53±1.760 39.39±3.681**28.71±3.038**△△30.70±1.033**△△30.10±1.325**△△FSH/mIU·mL-1 2.34±0.155 4.28±0.155**2.66±0.162**△△3.43±0.129**△△◇◇3.36±0.150**△△◇◇LH/mIU·mL-1 5.32±0.300 8.64±0.521**5.61±0.094**△△5.58±0.143**△△5.30±0.152△△◇○F 38.63 223.7 226.6 P 0.000 0.000 0.000

4 討論

乳腺是性激素的重要靶器官之一，高水平雌激素環境是女性乳腺癌發生的重要危險因素，乳腺癌多屬激素依賴性腫瘤[4]，其比例高達70%～80%[5]。乳腺增生等疾病有一定的癌變傾向，周期性的性激素分泌失調或乳腺組織對激素的敏感性增高是乳腺癌前病變發生的重要機制[6]。雌激素、孕激素可提高乳腺上皮細胞的增殖率，在乳腺癌的發生、發展中有重要作用[7]。通常情況下，在增生越活躍的組織中，雌激素、孕激素強陽性的陽性表達率越高，其與乳腺癌及癌前病變的相關性越大。因此，推測在乳腺癌癌前病變期，或可通過調節性激素水平降低其癌變率，改善預后。

關于乳腺癌，在古代醫書中有多種記載，如“乳巖”“石癰”“乳核”等[8]。中醫學認為，乳腺癌的發病多與情志有關。若情志失調則氣不行津，津液停留而凝聚成痰；復因肝木克土，致脾胃不能升清降濁，則內生痰濁；而氣滯痰凝血瘀日久停于乳絡則結為腫塊。認為其基本病機為肝郁氣滯、沖任失調[9]。故防治上尤其注重疏理肝氣，化瘀解毒。而脾為后天之本，氣血生化之源，故遣方多配合健脾益氣之品。

“疏肝健脾解毒方”是我院防治乳腺癌的經驗方，由柴胡、郁金、茯苓、白術、半枝蓮、白花蛇舌草、蒲公英組成。方中柴胡、郁金疏肝解郁，理氣活血，為君藥；白花蛇舌草、半枝蓮、蒲公英清熱解毒，為臣藥；茯苓、白術益氣健脾，輔助正氣，以防攻伐太過，為佐藥。全方藥物配伍精要，疏肝健脾、清熱解毒、扶正抗癌，標本兼治。

本研究通過化學藥物灌胃聯合夾尾法制備乳腺癌癌前病變肝郁證大鼠模型，驗證疏肝健脾解毒方對乳腺癌癌前病變肝郁證大鼠模型血清雌二醇、孕酮、催乳素、黃體生成素和卵泡刺激素水平的影響，結果提示疏肝健脾解毒方可有效調節乳腺癌癌前病變肝郁證模型大鼠血清性激素水平，可為其臨床防治乳腺癌作用提供實驗依據。

[1]索龍格，楊順娥.雙側原發性乳腺癌發病的臨床相關性因素分析[J].實用癌癥雜志，2017,32(6):916-919.

[2]李華艷.加減逍遙散聯合姑息性化療治療中晚期乳腺癌患者臨床療效觀察[J].當代醫學，2017,23(15):122-124.

[3]宋愛莉，梁 棟，殷玉琨，等.大鼠乳腺癌癌前病變肝郁證造模的研究[J].中華中醫藥學刊，2010,28(1):5-7.

[4]于 付，鄭榮生.乳腺癌內分泌治療耐藥的研究進展[J].中國腫瘤，2017,26(5):388-394.

[5]徐 蓉，陳 斌.乳腺癌內分泌藥物治療研究[J].黑龍江醫學，2014,38(8):883-886.

[6]賈 敏，褚 靜，周玲玲.肝郁氣滯證乳腺增生大鼠血中激素水平的變化[J].甘肅中醫，2010,23(4):22-24.

[7]彭舟麗，阮祥燕.雌孕激素與乳腺癌[J].國外醫學腫瘤分冊，2005,32(5):381-384.

[8]張文嫻，李 瀾，賈 波.從溫陽論治乳腺癌[J].亞太傳統醫藥，2017,13(8):89-90.

[9]李琳霈，潘 博，杜小艷，等.潘敏求教授從“瘀、毒、虛”論治乳腺癌經驗[J].湖南中醫藥大學學報，2017,36(4):38-40.

（本文編輯 楊 瑛）

Effect of Shugan Jianpi Jiedu Decoction on Serum Sex Hormone Levels of Breast Precancerous Lesion in Liver Depression Model Rats

LI Linpei1,YANG Xiao2,PAN Bo1,JIANG Yilan1*
(1.Affiliated Hospital of Hunan Academy of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410006,China;2.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

ObjectiveTo study the effect of Shugan Jianpi Jiedu decoction on serum sex hormone levels of breast precancerous lesion in liver depression model rats.MethodsThe breast precancerous lesion of liver depression rat models were prepared by intragastric administration of two methyl benzene anthracene and tail clamping method.The rats were randomly divided into model group,Shugan Jianpi Jiedu decoction group,tamoxifen group,Xiaojinwan group,and blank control group.The levels of estrogen (E2),progesterone (P),prolactin PRL,follicle-stimulating hormone (FSH)and luteinizing hormone (LH)were measured by radioimmunoassay after 4 weeks medication respectively.ResultsThe levels of E2,P,PRL,FSH and LH in the model group were higher than those in the blank group,the differences were statistically significant(P＜0.01).The serum sex hormone levels in the treatment groups were lower than those in the model group,the differences were statistically significant(P＜0.01).The estradiol and luteinizing hormone levels in Shugan Jianpi Jiedu decoction group were lower than those in the control groups,the differences were statistically significant (P＜0.05).The P,FSH and PRL levels in Shugan Jianpi Jiedu decoction group were higher than tamoxifen group,lower than Xiaojinwan group,there was significant difference between the levels of P(P＜0.01),there was no significant difference in the levels of FSH and PRL(P＞0.05).ConclusionShugan Jianpi Jiedu decoction could effectively reduce serum sex hormone levels of breast precancerous lesion in liver depression model rast.

breast cancer;precancerous lesion;Shugan Jianpi Jiedu decoction;sex hormone

R285.5；R737.9

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2017.11.008

本文引用：李琳霈，楊 曉，潘 博，蔣益蘭.疏肝健脾解毒方對乳腺癌癌前病變肝郁證模型大鼠血清性激素水平的影響[J].湖南中醫藥大學學報，2017，37（11）：1200-1203.

2017-07-17

湖南自然科學基金資助項目（2016JJ6082），湖南省中醫藥管理局重點資助項目（201634）。

李琳霈，女，碩士，主治醫師，從事中醫腫瘤臨床工作。

*蔣益蘭，女，主任醫師，教授，博士研究生導師，E-mail:tianshangren624@163.com。