高效液相色譜法測定垂盆草-柴胡藥對不同比例配伍中槲皮素、山柰素、異鼠李素的含量

蔣志濤，呂玲燕，汪銅芳，2，陳曉峰，巫靜華*

(1.南京中醫藥大學附屬張家港醫院 江蘇省企業研究生工作站，江蘇 張家港 215600；2.南京中醫藥大學 藥學院，江蘇 南京 210023)

高效液相色譜法測定垂盆草-柴胡藥對不同比例配伍中槲皮素、山柰素、異鼠李素的含量

蔣志濤1，呂玲燕1，汪銅芳1，2，陳曉峰1，巫靜華1*

(1.南京中醫藥大學附屬張家港醫院 江蘇省企業研究生工作站，江蘇 張家港 215600；2.南京中醫藥大學 藥學院，江蘇 南京 210023)

目的考察垂盆草配伍柴胡后對總黃酮煎出量的影響。方法使用高效液相色譜法分別對單味垂盆草藥材的水煎液及不同比例垂盆草柴胡配伍后的單煎合液及合煎液中3種黃酮的總含量進行測定。結果不同比例垂盆草柴胡配伍的單煎合液中總黃酮的含量與垂盆草單煎液并無顯著性差異，合煎液中總黃酮的含量顯著增加。結論垂盆草配伍柴胡對總黃酮的煎出有促進作用。

垂盆草；柴胡；配伍；總黃酮

垂盆草具有利濕退黃、清熱解毒的功能，可用于濕熱黃疸、小便不利、癰腫瘡瘍的治療，垂盆草與其他藥物配伍后可增強其疏肝健脾、利濕退黃的效果[1-3]。在中醫藥理論中，垂盆草配伍柴胡具有非常廣泛的應用，如益肝樂顆粒，全方由垂盆草、柴胡、郁金等藥材組成，用于濕熱蘊蒸、身目俱黃或兩脅痞滿、疼痛、體倦懶食、溲赤便溏、舌苔黃膩等，急、慢性肝炎屬上述證候者。垂盆草能利濕退黃、清熱解毒，柴胡則可疏肝解郁、升舉陽氣，兩藥配伍用有非常廣泛的藥理作用[4-6]。楊潔文等[7]通過使用不同劑量柴胡垂盆草湯灌胃對化療藥物(匹服平)所致的肝損傷小鼠的保護作用，發現治療組與模型組血清學測試及病理學表現均存在顯著性差異。垂盆草配伍柴胡前期多注重藥理學方面的研究，對其化學成分的研究卻很少見[8-10]，本文以高效液相色譜法觀察垂盆草與柴胡不同比例配伍對垂盆草有效成分槲皮素、山柰素、異鼠李素3種黃酮總含量煎出率的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀、Waters 2998二極管陣列檢測器、Epower2化學工作站、分析天平(Shimadzu Aux220)。

1.2 材料

槲皮素對照品、山柰素對照品、異鼠李素對照品(成都曼斯特科技開發有限公司，批號分別為13122506、14010701、13053007)；甲醇為色譜純(德國默克)；水為娃哈哈純凈水；鹽酸為分析純。

垂盆草、柴胡藥材飲片均來自張家港市中醫醫院藥劑科，經張家港市中醫醫院余輝副主任中藥師鑒定均符合2015版《中華人民共和國藥典》一部項下規定。

2 方法與結果

2.1 樣品溶液的制備

按表1規定處方量準確稱取各味藥，充分混勻后分別置于1000 mL燒瓶中，加8倍量水，煮沸后1 h，用4層醫用紗布過濾，殘渣加8倍水重復以上過程，合并2次濾液，定容至藥材總重的20倍量，采取相同的加水倍數、煎煮次數及煎煮時間，分別煎煮，每組平行制備兩份。精密量取垂盆草及柴胡單煎液，配制成垂盆草與柴胡煎出液分別為2∶1、1∶1、1∶2的單煎合液適量。每組平行制備兩份即得1～8號樣品溶液。

表1 不同藥物配比組成

2.2 HPLC檢測

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，色譜柱為Hedera ODS-2(200 mm×4.6 mm，5 μm)；以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，選用不同比例的0.4%磷酸溶液(A)∶甲醇(B)為流動相，梯度洗脫，條件見表2。

2012年鎮江市積極采取措施進行智慧城市建設并取得一定成效［2］。2016年在《鎮江市“十三五“規劃綱要》中，鎮江市人民政府明確提出要推進“智慧鎮江”建設，全面提升一體化基礎設施建設水平。2018年鎮江市榮獲“2018中歐綠色智慧城市獎”。目前鎮江智慧城市建設已經進入發展新階段。揚中市智慧城市建設一方面能夠為鎮江下屬縣級市例如丹陽、句容、丹徒等提供建設樣本，以點帶面整體推進鎮江全市范圍內的智慧建設；另一方面，揚中市加強與鎮江產業合作創新，對傳統產業進行升級轉型，促進經濟共享、資源共享、共同發展，為鎮江經濟社會發展貢獻力量，進一步推動“智慧鎮江”建設。

表2 流動相梯度洗脫程序

2.3 溶液制備

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取槲皮素、山柰素、異鼠李素19.20、5.01、5.25 mg，分別置于不同的10 mL容量瓶中，加適量甲醇溶解，并用甲醇定容至刻度，搖勻備用。分別取1 mL上述對照品溶液置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度，制成每1 mL含槲皮素、山柰素、異鼠李素分別為0.076 8、0.020 04、0.021 mg的混合對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密吸取上述樣品溶液20 mL，置于蒸發皿中，水浴鍋上蒸干，精密量取甲醇-25%鹽酸溶液(4∶1)混合溶液25 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，用上述混合溶液補足重量，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 系統適用性考察 分別精密吸取混合對照品溶液和1號供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按2.2項下色譜條件測定。色譜圖見圖1。結果顯示，在供試品溶液中槲皮素、山柰素、異鼠李素與對照品有相同的保留時間。

2.4.2 專屬性試驗 在與樣品測定完全相同的條件下，精密吸取2號供試品項下的柴胡水煎液10 μL，連續進2針，發現陰性無干擾，色譜圖見圖1中C。說明垂盆草中槲皮素、山柰素、異鼠李素專屬性較強。

注：A.混合對照品；B.供試品；C.陰性樣品；1.槲皮素；2.山柰素；3.異鼠李素。圖1 對照品、供試品、陰性對照溶液的HPLC圖

2.4.3 線性關系考察 精密吸取混合對照品溶液各1、2、4、6、10、12 μL進樣，測定峰面積，以槲皮素、山柰素、異鼠李素的進樣量(μg)為橫坐標X，以三者峰面積為縱坐標Y，各自進行線性回歸，槲皮素線性回歸方程：Y=3 072 031.2X-13 231.4，r=0.999 9；山柰素的線性回歸方程：Y=3 062 657.1X-6 241.3，r=0.999 8；異鼠李素的線性回歸方程：Y=2 583 461.7X-9 123.2，r=0.999 9。結果表明，槲皮素、山柰素、異鼠李素分別在0.076 8～1.92、0.020 04～0.501、0.021～0.525 μg線性關系良好。

2.4.4 精密度試驗 精密吸取每1 mL含槲皮素、山柰素、異鼠李素分別為0.076 8、0.020 04、0.021 mg的混合對照品溶液，按照2.2項下色譜條件，重復進樣6次進行分析測定，進樣量均為10 μL。分別測定槲皮素、山柰素、異鼠李素峰面積，結果計算得出槲皮素、山柰素、異鼠李素的峰面積的RSD分別為0.7%、0.8%、1.2%，表明精儀器的精密度良好，可用于進一步試驗分析。

2.4.5 穩定性試驗 精密吸取同一份樣品(垂盆草單煎液)按供試品溶液的制備方法，于室溫(20～25 ℃)下放置，分別于0、2、4、6、8、10 h進樣，每次進樣10 μL，按2.2項下色譜條件進行測定，記錄6次峰面積，結果10 h內RSD為0.98%，表明供試品溶液在10 h內穩定。

2.4.6 重復性試驗 精密吸取同一份樣品(垂盆草單煎液)，按供試品溶液的制備方法，共平行制備6份，分別精密吸取10 μL，按2.2項下色譜條件進行測定，結果槲皮素、山柰素、異鼠李素的平均含量分別為1.14、0.32、0.48 mg·g-1，各成分含量的RSD分別為1.2%、1.1%、1.4%，均符合要求，結果表明該方法重復性良好。

2.4.7 加樣回收率試驗 精密量取同一份樣品(垂盆草單煎液)10 mL，共6份，分別精密加入一定量的槲皮素對照品溶液(1.92 mg·mL-1)、山柰素對照品溶液(0.501 mg·mL-1)、異鼠李素對照品溶液(0.525 mg·mL-1)，上述溶液按2.1項下供試品溶液的制備方法分別制備6份，按2.2項下色譜條件進樣，分析測定，測定方法的回收率。測定結果見表3～5。

表3 槲皮素的加樣回收率試驗結果(n=6)

表4 山柰素的加樣回收率試驗結果(n=6)

表5 異鼠李素的加樣回收率試驗結果(n=6)

2.5 樣品測定

精密吸取2.1項下表1中除柴胡單煎液外的各樣品溶液，按供試品溶液的制備方法，每個配比平行制備兩分，共14份，分別精密吸取每1 mL含槲皮素、山柰素、異鼠李素分別為0.076 8、0.020 04、0.021 mg的混合對照品溶液及各供試品溶液各10 μL，連續進2針，采用隨行標準，用外標一點法測定，即得各個樣品3種黃酮成分的總含量，結果見表6。

表6 樣品測定結果(n=3)

注：與垂盆草單煎液比較▲P< 0.01。

精密吸取各樣品10 μL，分別進樣3次，按外標法計算3種黃酮類總含量，計算平均值，所得結果見表6。實驗結束，采用完全隨機設計的單因素方差分析(one-way ANOVA)進行統計學處理(P<0.01)組間差異采用Dunett-t檢驗。

3 討論

藥理學研究證明，垂盆草中黃酮類成分具有抗肝組織纖維化、保肝降酶、保護肝細胞的作用[11-16]?！吨腥A人民共和國藥典》2015版把槲皮素、山柰素、異鼠李素作為控制垂盆草藥材的質量指標，因此，本實驗研究以3種黃酮的總含量作為考察的指標。垂盆草與柴胡相須為用，可增強保肝降酶、止痛之力。有研究表明，在垂盆草與柴胡配伍的諸多方劑中，兩者以1∶1配伍比例出現頻率最多。因此我們選擇2∶1、1∶1、1∶2的不同配伍比例進行研究。

在本實驗選定的色譜條件下，3種黃酮成分得到較好的分離，無雜峰干擾測定。垂盆草單煎液與柴胡-垂盆草配伍水煎液是按照傳統中藥煎煮方法平行操作制得，以此來考察煎煮過程中柴胡對垂盆草總黃酮的影響。單煎合液采用兩種藥材單獨煎煮后所得的煎液按比例混合，以此考察兩者簡單混合時柴胡對垂盆草總黃酮煎出率的影響。兩種情況綜合考慮，研究單獨煎煮合并和合煎的合理性，據此研究柴胡-垂盆草配伍對3種黃酮類成分的影響是科學可行的。

垂盆草單煎液中總黃酮煎出量為(1.964 7±0.468 3)mg·g-1，合煎液3種配比組成總黃酮煎出量依次為(2.107 3±0.004 1)、(2.136 0±0.019 4)、(2.249 2±0.003 2)mg·g-1，單煎合液不同配比總黃酮含量依次為(1.932 9±0.001 6)、(1.923 2±0.008 8)、(1.946 4±0.020 2)mg·g-1。由上可知，單煎合液與垂盆草單煎液相比，不存在顯著性差異(P>0.01)，說明在混合的過程中，柴胡對垂盆草中的總黃酮無顯著影響。合煎液中總黃酮煎出量與垂盆草單煎液相比含量顯著增加(P<0.01)，說明柴胡垂盆草合煎后對垂盆草中的總黃酮溶出有促進作用，不同配比之間沒有明顯的規律。故筆者推測垂盆草和柴胡配伍可能是在煎煮過程中通過影響總黃酮的含量來影響藥效的，而兩者單獨煎煮后混合并無顯著影響，也就是說兩者配伍不能簡單地混合，必須共同煎煮才可行。中藥成分復雜，不能根據某一種或幾種有效成分的含量來判斷藥效，因此在后續的實驗研究中應盡可能選取多指標成分進行研究，結合化學指標和藥效學指標進行綜合考察。

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DeterminationofContentofQuercetin，KaempferideandIsorhamnetininDrugPairHerbaSediSarmentosiandRadixBupleuriofDifferentProportionsbyHPLC

JIANGZhitao1，LYULingyan1，WANGTongfang1，2，CHENXiaofeng1，WUJinghua1*

(1.ZhangjiagangHospitalofTraditionalChineseMedicine，AffiliatedHospitalofNanjingUniversityofChineseMedicine；GraduateworkstationofenterprisesinJiangsuProvince，Zhangjiagang215600，China，2.NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China)

Objective：To examine the effect of drug pair Herba Sedi Sarmentosi and Radix Bupleuri in different proportions on extract amount of quercetin，kaempferide and isorhamnetin.MethodsThe contents of quercetin，kaempferide and isorhamnetin in decoctions of Herba Sedi Sarmentosi，Radix Bupleuri as well as Herba Sedi Sarmentosi and Radix Bupleuri in different proportions were determined by HPLC，respectively.ResultsThere was no significant difference in flavonoids content of separated decocted Herba Sedi Sarmentosi and Radix Bupleuri in different proportion，and Herba Sedi Sarmentosi decoction.The total flavonoid content in together decocted Herba Sedi Sarmentosi and Radix Bupleuri increased significantly.ConclusionRadix Bupleuri enhances the extraction of total flavonoid in Herba Sedi Sarmentosi decoction.

Herba Sedi Sarmentosi；Radix Bupleuri；compatibility；total flavonoids

蘇州市科技發展計劃項目(SYSD2017161,SYSD2015165)

*

巫靜華，主管中藥師，研究方向：中藥制劑及質量分析研究；Tel：(0512)56380621；E-mail：334582090@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.11.028

2017-02-11)