蜂王漿高產蜜蜂與意大利蜜蜂工蜂上顎腺磷酸化蛋白質組分析

李爽，李建科

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蜂王漿高產蜜蜂與意大利蜜蜂工蜂上顎腺磷酸化蛋白質組分析

李爽，李建科

（中國農業科學院蜜蜂研究所，北京 100093）

工蜂上顎腺的主要生物學功能是分泌脂肪酸為蜂群提供營養，并參與報警外激素的合成。蜂王漿高產蜜蜂(漿蜂，)和意大利蜜蜂(意蜂，)是中國主要蜂種，但磷酸化蛋白質組調控其上顎腺的發育和功能的機理尚未開展研究。通過比較二者工蜂上顎腺磷酸化蛋白質組的差異，揭示磷酸化蛋白質組調控上顎腺發育及脂肪酸代謝機理。解剖漿蜂、意蜂工蜂出房蜂、哺育蜂(10日齡左右)、采集蜂頭部，取其上顎腺，進行蛋白質提取、液內酶切，采用固相金屬離子親和層析色譜法(IMAC)進行磷酸化肽段富集，采用Zip-tip C18柱對肽段除鹽，通過LC-MS/MS(液相色譜與二級質譜串聯)對樣品進行分析，首先根據MaxQuant和Persues軟件對數據質量進行評估、主成分分析、表達譜聚類定量分析。然后利用PEAKS軟件對質譜數據進行蛋白質定量和定性分析，根據定性和定量分析結果，對漿蜂和意蜂上顎腺磷酸化蛋白質組進行生物學進程和KEGG代謝通路富集的生物信息學分析比較。最后利用Scaffold PTM軟件確定磷酸化位點、預測磷酸化肽段的基序類型。漿蜂3個時期分別鑒定到2 225、1 922、2 159個磷酸化蛋白，意蜂分別鑒定到1 740、1 592、1 682個磷酸化蛋白，漿蜂的磷酸化蛋白數目顯著高于意蜂，說明漿蜂上顎腺的磷酸化調控網絡較意蜂復雜。盡管它們上顎腺的磷酸化過程存在很大差異，但幼蜂、哺育和采集3個時期的磷酸化蛋白表達譜均相似，說明漿蜂和意蜂3個時期表達的磷酸化蛋白質執行類似的生物學功能來保障腺體的發育和分泌活動。對每個時期磷酸化蛋白質組比較，發現漿蜂和意蜂上顎腺3個發育時期的磷酸化蛋白質組均存在顯著差異，其中哺育蜂時期二者的差異最大，漿蜂有87個磷酸化蛋白高表達，主要參與能量和脂肪酸代謝，說明其上顎腺的脂肪酸合成力加強(包括10-HDA)，滿足蜂王漿產量提高的同時10-HDA含量增加，為其種群繁衍提供必要營養，而意蜂上調表達41個蛋白，主要參與能量代謝。漿蜂、意蜂各時期均識別到酸性、堿性和脯氨酸介導的3種類型motif；哺育蜂時期漿蜂特異識別到的motif對應激酶家族與細胞增殖相關，可能支持其上顎腺形態發育，與漿蜂分泌能力增強相關。漿蜂和意蜂在3個時期均通過加強不同的磷酸化蛋白質組來支撐上顎腺的發育及功能，其中最顯著的差異在哺育蜂時期，漿蜂哺育蜂顯著提高了脂肪酸合成力，保障其蜂王漿的基本功能。這在蛋白質修飾的水平上深入了解漿蜂蜂王漿高產的產漿生物學機理。

漿蜂；意大利蜜蜂；上顎腺；磷酸化蛋白質組

0 引言

【研究意義】蜂王漿是由工蜂咽下腺、上顎腺為主等腺體共同分泌的淡黃色乳漿狀物質[1]，富含蛋白質和脂肪酸，是蜂王和幼蟲的食物，其中所含的脂肪酸在蜂群營養[2]和幼蟲發育[3]方面發揮重要作用。其中一種不飽和脂肪酸10-羥基-2癸烯酸（10-HDA）[4]，因其在自然界中僅蜂王漿中存在，又被稱為“王漿酸”。蜂王漿中10-HDA的含量是評價蜂王漿質量的重要標準和貿易標準之一[5]。蜂王漿同時還是一種對人類健康具有重要作用的天然功能性保健品，具有調節人體血壓[6]、提高免疫力[7]、消炎抗菌[8]等功效。20世紀90年代中國從意大利蜜蜂（意蜂，，ITBs）中培育出蜂王漿高產蜜蜂（漿蜂，RJBs），漿蜂和意蜂為同一亞種，是意蜂的一個品系[9-10]，漿蜂的蜂王漿產量約為意蜂10倍以上，一群漿蜂可年產約10 kg蜂王漿[11]。中國蜂王漿年產量達4 000多噸[12]，是世界第一生產大國，漿蜂的選育為中國蜂王漿產業發展發揮巨大貢獻。然而在漿蜂蜂王漿高產的同時，10-HDA含量出現一定程度的下降，因此，明確究竟是漿蜂上顎腺生理機能未隨著產漿量提高而增強還是其他環境因素所致，對于提高10-HDA含量具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】上顎腺是蜜蜂頭部一對與上顎相連的袋狀外分泌腺體[13]。蜂王上顎腺分泌物主要是各類信息素，用于蜂群的交流和維護蜂群穩定[14-15]。工蜂上顎腺主要分泌幼蟲食物所需脂肪酸[16]和2-庚酮等作為報警信息素[17]。上顎腺基因組學研究表明，與蜂王相比，工蜂上顎腺中脂肪酸合酶（fatty acid synthase，FAS）及高表達，表明上顎腺中有關脂肪酸代謝在不同級型間存在差異[18]。經過蜂王漿高產的選育，漿蜂和意蜂的咽下腺[19]、神經系統[20]的蛋白質組等方面已經出現了明顯分化，漿蜂咽下腺顯著提高了蛋白質合成力，以保證蜂王漿高產的生理需求[21]。神經系統為了保證蜂王漿高產的需求，漿蜂大腦的神經肽加強了對幼蟲信息素識別、花粉采集、水代謝平衡的調控能力[20]。這些神經生物學功能的加強在行為和生理上在保證漿蜂蜂王漿的蛋白質種類和含量與意蜂沒有差異[21]，且比中蜂蜂王漿蛋白的含量還顯著提高[22]。上顎腺蛋白質組研究表明，剛出房幼蜂上顎腺表達的蛋白主要是用于腺體的初始發育；哺育蜂時期，上顎腺蛋白質組主要與分泌行為有關，且漿蜂脂肪酸合成能力顯著高于意蜂[11]；采集蜂時期，上顎腺表達的蛋白可以增強蜜蜂的采集效率和對蜂巢的守衛能力[11]。蛋白質磷酸化作用是一種重要的蛋白質翻譯后修飾形式，通常發生在絲氨酸（Ser，S）、蘇氨酸（Thr，T）、酪氨酸（Tyr，Y）殘基上[23]。蛋白質磷酸化修飾可以調控蛋白功能[24]，調控許多生命活動，如細胞周期[25]、生長、發育、凋亡[26]、信號轉導[27]等。在蜜蜂中，磷酸化蛋白參與調控多項生命活動，如幼蟲生長[28]、抗菌[29]抗病毒[30]以及咽下腺和大腦[31]的生長發育[23]等。研究表明，磷酸化蛋白質組對咽下腺腺體發育以及核糖體活性具有重要的調控作用，從而調節蜂王漿蛋白的合成、翻譯過程[23,32]。最新研究表明，哺育蜂和采集蜂大腦蛋白質的磷酸化通過調節蛋白質的功能使其支持不同生理年齡工蜂的神經生理活動，進而調控蜜蜂的哺育和采集行為。蛋白質磷酸化通過調節糖代謝和糖原生成等代謝途徑加強哺育蜂的哺育功能，而磷酸化蛋白通過調節光傳導通路加強采集蜂的條件采集能力[31]。然而磷酸化蛋白質如何調控上顎腺發育機制及脂肪酸代謝機理尚未開展研究?！颈狙芯壳腥朦c】針對蜂王漿產業的理論問題，在磷酸化蛋白質組水平研究上顎腺磷酸化蛋白質對其發育的調控和脂肪酸代謝機理進行研究?！緮M解決的關鍵問題】闡明漿蜂上顎腺磷酸化蛋白質組調控其腺體發育和脂肪酸代謝機理，為蜂王漿優質高產提供理論依據和生產實踐基礎。

1 材料與方法

試驗于2016年9月至2017年5月在中國農業科學院蜜蜂研究所完成。

1.1 化學試劑

IMAC磷酸化肽段富集材料購自中國科學院大連化學物理研究所；尿素購自Solarbio；Ti(SO4)2（硫酸鈦）、硫脲、CHAPS、Tris堿、DTT（二硫蘇糖醇）購自Amresco；蛋白酶抑制劑購自Roche，Basel；丙酮和TFA（三氟乙酸）購自J.T.Baker；Bradford工作液購自普利萊；IAA（碘乙酰胺）來自Merk公司；ACN（乙腈）購自Fisher；Trypsin酶購自Promega；甲酸購自MREDA Technology。

1.2 蛋白樣品制備

1.2.1 IMAC材料制備 稱取GTP微球200 mg于燒杯中，加入300 mL超純水，超聲混勻；按照GTP微球﹕Ti(SO4)2=1﹕100 稱量硫酸鈦20 g，緩慢加入燒杯中并攪拌，待其完全溶解放入磁鐵轉子；將燒杯置于磁力攪拌器上，室溫攪拌過夜；將攪拌好的材料分裝到50 mL離心管中，用少量超純水清洗燒瓶加入離心管中，配平，20 000 r/min，離心10 min，棄上清；超純水洗滌離心后材料，20 000 r/min，離心10 min，洗滌6次，盡量將非特異性吸附鈦離子洗凈；用200 mmol·L-1NaCl溶液洗滌上述材料，20 000 r/min，離心10 min，洗兩次；再用超純水洗滌上述材料，20 000 r/min，離心10 min，洗2—3次，保留沉淀；用30 ml超純水懸浮材料，分裝至30個1.5 mL離心管中，每管1 mL，12 500 r/min，離心15 min，棄上清，旋轉蒸發儀干燥。后儲存于4℃備用。

1.2.2 樣品準備 試驗所用漿蜂和意蜂均飼養于中國農業科學院蜜蜂研究所試驗蜂場，漿蜂來自中國浙江省，意蜂來自意大利。分別選取群勢相同的5箱漿蜂和意蜂，選取即將羽化出房的子脾置于培養箱中，第2天取一部分新羽化蜂用作出房蜂樣品，其余用油漆筆在其胸部背板進行標記，后放回原箱中。待第10天取出用作哺育蜂樣品。在蜂箱門口抓取帶有花粉團的歸巢蜜蜂用作采集蜂樣品。用體式顯微鏡解剖蜜蜂頭部，取得上顎腺樣品。樣品取自5個蜂群，每群取300只，然后將5群樣品合并，存于-80℃備用。

1.2.3 蛋白提取 蛋白提取按照HAN等[30]的方法，每30 mg上顎腺樣品加入300 μL樣品裂解液（8 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲，4% CHAPS，20 mmol·L-1Tris-堿，30 mmol·L-1二硫蘇糖醇（DTT），1 mg/10 μL）及蛋白酶抑制劑，冰浴充分研磨，超聲，使樣品完全溶解。4℃，15 000×，離心20 min。避開脂肪層取上清液，加入3倍體積預冷的丙酮溶液，冰浴沉淀30 min。4℃，15 000×，離心20 min。棄上清。開口2—3 min讓丙酮揮發，后將沉淀重新溶解于100 μL的5 mol·L-1尿素中，再加入400 μL（4倍體積）40 mmol·L-1NH4HCO3。使用Bradford方法測定最終的蛋白濃度。

1.2.4 液內酶切 加入50 μL（1/10總體積）100 mmol·L-1DTT，4℃放置1 h，加入250 μL（5倍DTT體積）100 mmol·L-1IAA，避光放置1 h。按照酶﹕蛋白=1﹕50（W/W）比例加入Trypsin胰蛋白酶，37℃下進行消化反應24 h，后加入1 μL甲酸終止酶切。4℃，14 000×，離心15 min，取500 μL上清液轉移至新管。

1.2.5 磷酸化肽段富集 用500 μL的binding buffer（80% ACN & 6% TFA水溶液）重懸一管IMAC材料；在1.2.4上清液中加入重懸的IMAC材料，30 μL TFA；振蕩2 h，14 000×離心10 min，棄上清；加入1 mL washing buffer 1（50% ACN & 6% TFA & 200 mmol·L-1NaCl水溶液），振蕩30 min，14 000×，離心10 min，棄上清；加入1 mL washing buffer 2（30% ACN & 0.1% TFA水溶液），振蕩30 min，14 000×，離心10 min，棄上清；加入100 μL elution buffer（500 mmol·L-1K2HPO4，pH 7），振蕩30 min，14 000×，離心10 min，取上清至新管，重復上述操作。

1.2.6 Zip-tip C18除鹽 活化：在50% ACN，0.3% TFA水溶液中反復吹打10次，活化C18柱子；平衡：在equilibrium buffer（0.1% TFA水溶液）中反復吹打10次，平衡C18柱子；富集：用Zip-tip反復吹打樣品10次（避免產生氣泡）；洗脫：取30μLelution buffer（80% ACN，0.1% TFA水溶液）至新管，用Zip-tip反復吹打10次，將肽段洗脫；用水吹打3—5次，洗去elution buffer，重復富集、洗脫及用水吹打步驟5次左右；干燥：干燥上步中elution buffer。

1.3 質譜分析

用100μL 0.1%甲酸溶解干燥樣品，4℃，14 000×離心15 min，取50 μL上清于上樣管中，同時避免有氣泡；將上樣管放入色譜儀樣品槽，每針上樣體積8 μL，每個樣品做3針重復。采用納升級液相色譜系統EASY-nLC 1000（Thermo Fisher Scientific）通過納升電噴霧源與質譜Q-Exactive（Thermo Fisher Scientific）串聯，上樣流速5 μL·min-1。流動相A（0.1%甲酸），流動相B（0.1%甲酸 & 80% ACN）；通過納升ESI源將洗脫的肽段注入質譜儀。以數據依賴模式收集離子信號，參數設置如下：母離子掃描分辨率為70 000，400 m/z，荷質比范圍：300—1 800 m/z，對豐度最高前20個母離子碎片離子通過高能碰撞誘導解離模式，MS/MS掃描分辨率為17 500，碰撞能：27，動態剔除（帶電荷為1或者＞8的剔除；動態剔除：10 s）。通過Xcalibur軟件（版本2.2，Thermo Fisher Scientific）收集MS/MS數據并保存為Raw文件。

1.4 數據處理與分析

1.4.1 數據質量評估 利用MaxQuant 1.5.8.3對質譜數據進行蛋白質定量，Andromeda用于數據庫搜索[33]：采用的是蜜蜂數據庫（2017年2月從NCBI下載，22 473條目并包含13個常規污染庫）。參數設置如下：“Group-specific parameters”選項卡中“Digestion”（酶特異性）選擇“Tryspin/P”；“Modifications”（可變修飾）選擇“Oxixidation（M）、Acetyl（Protein N-term）、Phospho（STY）”；“Label-free quantification”（非標記定量）選擇“LFQ”；“Global parameters”選項卡中“adv. identification”勾選“Match between runs”；“Protein quantification”中“Label min. ratio count”選擇“1”；“Label free quantification”勾選“Separate LFQ in parameter groups”。

1.4.2 PEAKS 采用PEAKS 7.5軟件進行數據庫搜索，數據庫與MaxQuant所用數據庫相同。參數設置如下：先進行從頭測序（De novo）計算，Enzyme選擇Tryspin（TPCK修飾的胰蛋白酶）；fixed modifications（固定修飾）選擇Carbamidomethyl（氨甲酰甲基）；variable modifications（可變修飾）選擇Oxidation（M）和 Phosphorylation （STY）；母離子質量數誤差范圍（Precursor mass）為30.0 ppm；碎片離子誤差范圍（Fragment ion）為0.05 Da；每條肽段最多允許有兩個漏切位點（Maximum missed cleavages per peptide:2）；每個肽段最多允許有3種翻譯后修飾（Maximum allowed variable PTM per peptide）；搜庫完成后，采用假陽性率（FDR）≤1.0%及鑒定到的蛋白中特有肽段（unique peptide）≥1這兩個條件對搜庫結果進行篩選。運用PEAKS Q板塊對搜庫結果進行定量，參數如下：保留時間（retention time shift tolerance）：0.5 min；質量誤差范圍（mass error tolerance）：30 ppm；特有肽段（unique peptide）≥1；電荷范圍（charge between）：2—8；蛋白和肽段都是差異倍數（fold change）≥1.5，≤0.05（significant≥13）。

1.5 生物信息學分析

1.5.1 Perseus分析 將MaxQuant搜庫結果導入Perseus軟件進行數據質量評估，根據肽段豐度進行聚類定量分析、主成分分析。

1.5.2 磷酸化肽段motif分析 將PEAKS搜庫結果導入Scaffold PTM軟件確定磷酸化位點，以蜜蜂數據庫（2017年2月從NCBI下載，22 460條目）為背景，預測磷酸化肽段的基序類型。

2 結果

2.1 數據質量評估

通過Perseus軟件對數據進行質量評估，從多聚散點圖（圖1）可以看出，各樣品間重復性較好，數據分布較集中；同一蜂種同一樣品間皮爾森相關系數在0.85—0.96，樣品重復性較好；但不同蜂種不同樣品間相關系數在0.57—0.88，重復性較差。這表明數據質量較好。

2.2 漿蜂、意蜂上顎腺不同發育時期磷酸化蛋白質、肽段、位點鑒定

對漿蜂和意蜂出房蜂、哺育蜂和采集蜂上顎腺進行磷酸化蛋白質組分別進行分析。漿蜂各時期的磷酸化蛋白、肽段、位點數均多于意蜂，分別鑒定到2 225、1 922、2 159、1 740、1 592、1 682個磷酸化蛋白的4 799、3 882、4 808、3 593、2 719、3 679條肽段上658、646、517、700、750、639個化位點發生磷酸修飾（圖2-B—D）。其中出房蜂時期漿蜂和意蜂共有磷酸化蛋白最多，為1 468個，分別占意蜂、漿蜂出房蜂蛋白總數84%、66%；哺育蜂時期，共有蛋白最少，為1 144個，分別占意蜂、漿蜂出房蜂蛋白總數71.8%、59.5%；采集蜂時期，共有蛋白1 289個，分別占意蜂、漿蜂出房蜂蛋白總數76.6%、59.7%（圖2-A）。

數字代表皮爾森相關系數The numbers indicated the value of Pearson correlation coefficients

A—D分別為漿蜂和意蜂不同時期共有蛋白、磷酸化蛋白、肽段、位點數目A-D were the numbers of shared proteins, phosphoproteins, phosphopeptides and phosphosites of RJBs and ITBs at different stages, respectively

2.3 漿蜂、意蜂不同時期上顎腺磷酸化蛋白主成分分析

對漿蜂和意蜂不同時期上顎腺蛋白質組做PCA分析，出房蜂蛋白質組彼此最相近，采集蜂次之，而漿蜂和意蜂哺育蜂距離最遠，磷酸化蛋白質組差異最大，主成分1、2分別占變異性的20.7%、15.3%（圖3）。

2.4 漿蜂、意蜂motif分析

漿蜂、意蜂各時期磷酸化肽段均富集到3種motif（圖4）：酸性、堿性、脯氨酸介導的motif，但不同蜂種間各時期motif數量不同。漿蜂、意蜂的出房蜂、哺育蜂時期motif數量：脯氨酸介導＞酸性＞堿性；采集蜂時期脯氨酸介導＞堿性＞酸性。意蜂脯氨酸介導的motif數量下降，堿性motif上升，酸性motif先上升后顯著下降；漿蜂酸性、脯氨酸介導的motif數量下降，堿性motif數量上升。對漿蜂、意蜂不同時期各類motif識別到的激酶家族進行分析（表1），脯氨酸介導的motif主要識別到4類激酶家族：WW domain binding、GSK-3, ERK1, ERK2, CDK5 substrate、GSK3, Erk1, Erk2 and CDK5 kinase和Casein kinase I substrate，其中Casein kinase I substrate激酶家族為漿蜂出房蜂時期特異識別到的。酸性的motif 主要識別到2類激酶家族：Pyruvate dehydrogenase kinase substrate、Casein kinase II substrate，其中Pyruvate dehydrogenase kinase substrate激酶家族為哺育蜂時期特異識別到的。堿性的motif主要識別到2類激酶家族：PKC epsilon kinase substrate、14-3-3 domain binding。其中14-3-3 domain binding激酶家族為采集蜂時期特異識別到的。哺育蜂時期，漿蜂較意蜂特異識別到GSK3, Erk1, Erk2 and CDK5 kinase家族，并且Casein kinase II substrate、Pyruvate dehydrogenase kinase substrate家族（酸性motif）數目要高于意蜂；意蜂PKC epsilon kinase substrate家族（堿性motif）數目高于漿蜂。

圖4 漿蜂和意蜂不同發育時期上顎腺磷酸化肽段富集motif分布圖

2.5 差異蛋白定量分析

對上顎腺全蛋白質組與磷酸化蛋白質組進行聚類比較分析（圖5-A、5-B），可以看出漿蜂和意蜂各時期蛋白均各自聚類到同一組，相同的表達譜說明蛋白質組和磷酸化蛋白質組在2個不同層面上以類似的表達模式調控腺體的發育和功能。

出房蜂時期，漿蜂特有蛋白主要富集到胞內信號轉導、磷酸酶調節活性、蛋白激酶活性、RNA結合進程（圖6-A），意蜂特有蛋白主要富集到蛋白質磷酸化作用進程（圖6-B）。哺育蜂時期共鑒定到128個差異表達的蛋白，其中漿蜂高表達87個蛋白，意蜂有41個高表達蛋白（表2），其中多為能量代謝相關蛋白。意蜂高表達蛋白還參與蛋白質合成，漿蜂還包括部分與脂肪酸代謝相關蛋白：烯脂酰-輔酶A水合酶（probable enoyl-CoA hydratase，gi號328778689）、?；o酶A結合蛋白（acyl-CoA-binding domain- containing protein 5 isoform X2，gi號571571420）、乙酰輔酶A合成酶（acyl-CoA synthetase family member2 mitochondrial precursor，gi號332801003）、過氧化物酶（peroxiredoxin 1，gi號328777120）、細胞色素P450（probable cytochrome P450 6a14，gi號571568474）。

表1 漿蜂和意蜂各時期激酶家族

粗體名稱為各時期特異識別到的激酶家族 The bold marked name meant the specific recognized kinase family at different stages

A：上顎腺差異表達全蛋白；B：上顎腺差異表達磷酸化蛋白。每個樣品有3個重復?？v向代表漿蜂和意蜂不同時期差異表達蛋白。橫向代表不同蛋白。紅色和綠色分別代表上調表達和下調表達蛋白質A: differentially expressed whole proteins; B: differentially expressed phosphoproteins. Each sample had 3 replications. The columns represented differential proteins at different stages in RJBs and ITBs. The rows represented the individual protein. The up- or down-regulated proteins were labelled in red or green, respectively

3 討論

蛋白質磷酸化修飾是一種重要的翻譯后修飾方式，通過調控細胞訊號傳導[27]進而調控蛋白質功能[24]。雖經蜂王漿高產選育，漿蜂和意蜂上顎腺在不同發育階段表達的磷酸化蛋白都用于支持腺體的發育和分泌功能，即幼蜂上顎腺磷酸化蛋白質組主要支持腺體發育，哺育和采集蜂的磷酸化蛋白質組主要幫助腺體實現分泌功能。盡管不同發育時期磷酸化蛋白質組表達譜基本一致，但無論是磷酸化蛋白的數目還是肽段、位點的數目，漿蜂均多于意蜂，這表明經長期選育漿蜂上顎腺的磷酸化過程總體上較意蜂更為復雜。主成分分析（principal component analysis，PCA）通過降維的方式將高維數據投影到低維向量空間中，從而既保留數據的主要信息，又使其更易處理[34]。漿蜂和意蜂哺育蜂時期PCA的距離較遠，共有蛋白數目較少，進一步說明磷酸化蛋白質組的差異主要體現在哺育蜂時期，因為該時期是蜂王漿分泌的高峰，隨著漿蜂蜂王漿產量的提高，其中的10-HDA含量也要相應提高[11]以保證蜂王漿的營養功能，此時漿蜂上顎腺復雜的磷酸化過程可能是與漿蜂提高10-HDA的合成代謝相關。

表2 漿蜂和意蜂哺育蜂時期差異表達磷酸化蛋白

蛋白登錄號是與NCBI數據庫唯一對應的編號；變化倍數是差異蛋白相對于另一蜂種表達量的變化倍數

Accession number was the unique number given to the entry of a protein in the database of NCBI. Fold change was the comparison of protein abundance level between the RJB and ITB

A、B分別代表漿蜂、意蜂出房蜂特有蛋白富集的功能類

蛋白基序（motif）又稱為超二級結構，指相鄰的蛋白質二級結構單元相互接近，形成有規律的二級結構聚集體。即兩個或兩個以上二級結構單元由連接多肽連接起來，組合成有特殊幾何排列的局部空間結構。Motif有5種類型，脯氨酸介導的（pro-directed）、酸性的（acidic）、堿性的（basic）、其他（other）和酪氨酸介導的（tyrosine）[35]。蛋白質磷酸化修飾通過激酶實現，激酶識別蛋白質中相對應的motif氨基酸序列，蛋白在蛋白激酶和磷酸酶的作用下發生磷酸化和去磷酸化，激活或關閉某些信號通路[36]。在上顎腺發育的不同時期，漿蜂、意蜂motif數量發生變化；同一時期漿蜂motif總量高于意蜂，表明漿蜂較意蜂具有更復雜的磷酸化機制。漿蜂出房蜂時期特異識別到的Casein kinase 1激酶家族，常作為信號轉導途徑的調節因子，參與DNA修復和轉錄[37]，在Wnt信號通路中發生磷酸化等[38]。Wnt信號在動物胚胎的早期發育、器官形成過程中作用顯著[39]，在出房蜂時期支撐上顎腺的基礎發育。通路富集的結果表明漿蜂在出房蜂時期的蛋白質表達更為豐富，經過王漿高產的選育，漿蜂從出房蜂開始就與意蜂的上顎腺磷酸化蛋白質譜表現出差異。漿蜂高表達蛋白較多的集中在“Hippo”信號通路。此通路參與調節細胞增殖和凋亡[40]、細胞周期和生長發育等過程[41]，在漿蜂出房蜂時期高表達，說明漿蜂從出房蜂開始形態發育較意蜂更為發達，而上顎腺形態發育是其充分發揮功能的基礎，這可能與漿蜂哺育蜂時期分泌10-HDA能力增強有關。漿蜂、意蜂哺育蜂時期motif均特異識別到的Pyruvate dehydrogenase kinase（PDK）激酶家族，其底物是丙酮酸脫氫酶，可以催化丙酮酸轉化為乙酰輔酶A，從而參與TCA循環氧化供能，PDK進而調節細胞內能量代謝的過程[42]。乙酰輔酶A還是脂肪酸從頭合成的起始底物[43]。PDK在哺育蜂時期高表達，表明其可能參與調節哺育蜂時期能量供應和基礎物質的代謝。漿蜂哺育蜂較意蜂還特異識別到GSK3, Erk1, Erk2 and CDK5 kinase家族，它們都可調節細胞增殖分化相關過程[44-46]，GSK3激酶還可以調節能量代謝相關過程[47]。在漿蜂中特異識別到上述激酶家族，推測其可能支持漿蜂上顎腺的形態發育，從而為其充分發揮分泌功能提供基礎。脂肪酸合成的起始物質是乙酰輔酶A，通過合成硬脂酸（18C）[43]，進行脫氫、水化、再脫氫、硫解等一些列氧化循環步驟[48]，逐步生成低碳數脂肪酸。10-HDA的合成過程中發生脂肪酸的ω-氧化[43]，需要細胞色素P450酶的參與[49]，生成的脂酰輔酶A通過?；o酶A結合蛋白轉運進入過氧化物酶體，完成脂肪酸的-氧化過程[50]。其中水化反應需要烯脂酰輔酶A水合酶的參與[48]。漿蜂哺育蜂時期，乙酰輔酶A合成酶、細胞色素P450、?；o酶A結合蛋白、過氧化物酶、烯脂酰-輔酶A水合酶蛋白的高表達，為漿蜂哺育蜂分泌能力提高提供了物質基礎，與其大量合成10-HDA的現象相符，其證據是在非流蜜期，漿蜂和意蜂產漿量相差約10倍，但二者蜂王漿的10-HDA含量基本持平[11]。漿蜂、意蜂采集蜂時期motif均特異識別到的14-3-3蛋白家族，是一類保守的調節分子家族，14-3-3蛋白能夠結合多種信號蛋白[51]，包括Bcl-2相關死亡啟動子（BAD）蛋白[52]以及與細胞凋亡相關的信號通路蛋白等。這表明在采集蜂時期，上顎腺腺體功能發生轉變，調節相關的信號通路發生變化。其余非特異性識別到的激酶家族，例如GSK3糖原合成酶激酶3家族，也參與細胞增殖、凋亡相關的信號通路[53]和Wnt信號通路等[54]。

4 結論

通過對漿蜂和意蜂出房蜂、哺育蜂、采集蜂3個發育時期上顎腺磷酸化蛋白質組進行研究，發現在出房蜂時期，磷酸化蛋白主要促進腺體的基礎發育及形態發育，為哺育蜂時期大量產漿提供基礎；漿蜂和意蜂在3個發育時期采用不同的磷酸化蛋白質組來支撐上顎腺功能的發揮；其中哺育蜂時期，兩者間圖譜差異最大，磷酸化蛋白主要參與調控上顎腺能量代謝和脂肪酸代謝等過程，表明經過蜂王漿高產的選育，漿蜂已具有不同于意蜂的磷酸化蛋白質組，以維持其蜂王漿高產時10-HDA含量的提高，保證蜂王漿的營養功能。

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（責任編輯 岳梅）

Comparative Analysis of Phosphoproteome Between Mandibular Glands of High Royal Jelly Producing Bees and Italian Bees

LI Shuang, LI JianKe

(Institute of Apicultural Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093)

The principal biological function of worker bees’ mandibular glands is to secrete fatty acids to provide the nutrition for the colony and participate in synthesis of alarm pheromone. High royal jelly producing bees (RJBs,) and Italian bees (ITBs,) are both major honeybee species in China, but the mechanism of regulating the development and function of mandibular glands by phosphoproteome is not reported yet. The objective of this study is to compare the differences of mandibular glands of phosphoproteome, reveal the mechanism of the regulation of mandibular glands by phosphoproteome and fatty acids metabolism.The mandibular glands of newly emerged, nurse, and foragers of RJBs and ITBs were collected, then after, mandibular gland proteins were extracted and digested by an enzyme. Phosphopeptides were enriched by IMAC (immobilized metal-affinity chromatography) and desalted by using Zip-tip C18 columns. Peptides from each of the samples were analyzed by LC-MS/MS (liquid chromatography-mass/mass). Furthermore, MaxQuant and Perseus bioinformatics tools were used to evaluate phosphoproteome quality. These bioinformatics tools were further utilized for principal component and profiling hierarchical clustering quantification analyses. In addition, PEAKS software was employed for protein quantification and quality analyses. Finally, biological processes and KEGG metabolic pathways in mandibular glands of RJB and ITB were compared. Phosphosites were determined and motifs were predicted by using Scaffold PTM bioinformatics tool.The numbers of identified phosphoproteins of RJBs (2 225, 1 922, 2 159) were significantly higher than those of 1 740, 1 592, 1 682 in ITBs, illustrating that RJBs’ mandibular gland phosphorylation regulation network was likely more complicated than ITBs’. Although the phosphorylation process in mandibular glands of RJBs was significantly different from that in ITBs, a similar phosphoproteomes profiling across the gland development suggested that the phosphoproteins at distinct stages in RJBs and ITBs performed similar biological function to ensure the gland development and secretion activity. the glands of each stage in RJBs and ITBs had significant phosphoproteome differences, of which nurse bees were the most significantly diverged. Eighty-seven phosphoproteins were highly abundant in RJBs, and most of them were mainly related to energy and fatty acid metabolic process. These indicated the key roles of fatty acid metabolism in boosting the ability of fatty acid synthesis (including 10-HDA) in mandibular glands to prime the quantity of 10-HDA in royal jelly alongside the increased royal jelly production, which was essential for providing qualitative nutrition for the survival of population. Forty-one highly abundant phosphoproteins in ITBs were mainly related to energy metabolism.Three kinds of motifs were detected at each stage of glands in both RJBs and ITBs: acidic, basic and pro-directed. The unique kinase family recognized by motifs in nurse bees of RJBs was associated with cell proliferation, which might support gland morphological development and related to increased secretion capacity of RJBs.RJBs and ITBs have shaped different phosphoproteome signatures to maintain mandibular gland development and function at each stage. The most profound divergence occurs during the nurse stage, which RJBs may increase the ability of fatty acid synthesis to ensure the basic function of royal jelly. The data help us gain a novel understanding of the molecular underpinnings to drive enhanced high royal jelly production in RJBs at the level of protein modification.

high producing royal jelly bee; Italian bee; mandibular gland; phosphoproteome

2017-07-05；

2017-08-12

國家現代農業產業技術體系（蜜蜂）（CARS-44）、中國農業科學院科技創新工程（CAAS-591 ASTIP-2015-IAR）

聯系方式：李爽，E-mail：lishuang1230@icloud.com。通信作者李建科，Tel：010-82106448；E-mail：apislijk@126.com