非洲馬瘟病毒RT-LAMP檢測方法的建立

姜睿姣，鄔旭龍，張鵬飛，王 印,2*，楊澤曉,2，姚學萍,2

(1.四川農業大學動物醫學院，四川成都 611130；2.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川成都 611130)

研究論文

非洲馬瘟病毒RT-LAMP檢測方法的建立

姜睿姣1，鄔旭龍1，張鵬飛1，王 印1,2*，楊澤曉1,2，姚學萍1,2

(1.四川農業大學動物醫學院，四川成都 611130；2.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川成都 611130)

為了建立非洲馬瘟病毒(AHSV)環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)快速檢測方法，基于AHSV VP7基因保守序列，設計2對特異性擴增引物。通過對反應體系中各組分濃度，反應溫度及時間的優化，建立了快速、靈敏的AHSV RT-LAMP檢測方法，并對該方法特異性、靈敏度、重復性進行探索。結果表明，在63℃恒溫下反應45 min，便可進行高效率的特異性擴增。反應產物經瓊脂糖凝膠電泳和染料可視化鑒定，能夠快速有效檢測AHSV。用建立的方法檢測馬屬動物易感的4種疫病病原，結果均為陰性，證實具有較高的特異性。靈敏度是RT-PCR的1 000倍。建立了AHSV RT-LAMP檢測方法，具有快速、特異、靈敏、操作簡單、設備要求低的特點，適合用于現場AHSV快速檢測。

非洲馬瘟病毒；環介導等溫擴增；檢測

非洲馬瘟(African horse sickness,AHS)是由非洲馬瘟病毒(African horse sickness virus,AHSV)引起馬屬動物的一種急性或亞急性的蟲媒傳染病[1-2]。其主要病理特征有發熱、皮下組織水腫、肺水腫、臟器出血等。所有馬屬動物中，馬對此病最易感，病死率可高達90%。AHS被世界動物衛生組織(OIE)列為法定報告的動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。AHS主要流行于非洲撒哈拉沙漠以南地區，在歐洲、中東的部分國家和地區偶有發生[3]。

AHSV屬呼腸病毒科(Reoviridae)環狀病毒屬(Orbiviru)，現已知有9種血清型，不同型病毒的毒力強弱不相同，各型之間具有交互免疫關系，如5型與8型、6型與9型[3-4]。該病毒無囊膜，直徑約75 nm，基因組由10個大小不等的雙鏈RNA片段構成，共編碼7種結構蛋白(VP1-7)和4種非結構蛋白(NS1、NS2、NS3、NS3A)。其中VP7在ASHV各血清中高度保守，是該病毒的血清群特異性抗原[5]。

日本學者Notomi T等[6]發明了環介導等溫擴增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)。目前，RT-LAMP技術也廣泛用于RNA病毒的檢測，如SARS冠狀病毒、口蹄疫病毒[7-11]。與傳統PCR相比，該技術通?？稍?5min～60min內實現109倍～1010倍的擴增，白色產物焦磷酸酶沉淀可通過肉眼觀察到，除此以外，還能用熒光染色劑SYBR Green I染色觀察。LAMP不需要復雜的儀器設備，僅依靠2對～3對特異引物和一種鏈置換 DNA 聚合酶(Bst DNA polymerase)，在恒溫下短時間內便能高效、快捷、特異擴增靶序列。目前，LAMP方法已經廣泛應用于病原體的檢測，如豬細小病毒[12]。本研究建立了一種檢測非洲馬瘟病毒的RT-LAMP方法。

目前中國雖無非洲馬瘟的發生，但隨著各國貿易往來變頻繁、氣候改變，加之此病通過蚊蟲傳播，并不能完全保證AHS不會傳入進中國。因此，建立一種快速、靈敏、特異的檢測方法，有助于現場立即檢測出本病或排除本病，盡可能減小損失。

1 材料與方法

1.1 材料

馬傳染性貧血病毒(Equine infectious anemia virus，EIAV)、日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、鏈球菌(Streptococcus)、狂犬病病毒(Rabies virus,RV)由四川農業大學動物檢疫實驗室提供。利用DNA/RNA提取試劑盒提取病毒DNA/RNA，RNA反轉錄為cDNA，置-80℃保存備用。

1.2 主要試劑

Bst DNA聚合酶、Mg2+購于New England Biolabs(NEB)；dNTP、2×TaqPCR Master Mix、RNA反轉錄試劑盒、DNA Marker DL 2 000購于寶生物工程(大連)有限公司；質粒提取試劑盒、DNA/RNA提取試劑盒購于生工生物工程(上海)股份有限公司；其他試劑均為國產分析純產品。

1.3 方法

1.3.1 DNA的制備 在NCBI中獲取AHSV VP7基因序列(GenBank：KT030566.1)，通過DNAStar軟件比對分析，人工合成AHSV VP7保守基因序列。將載有目的基因質粒的菌株純培養后，利用質粒提取試劑盒提取目的基因質粒作為模板，送至華大公司測序鑒定后，置-80℃保存備用。

1.3.2 引物設計 根據GenBank公布的AHSV VP7保守基因序列，利用在線軟件 Primer Explorer V5，設計并篩選出2對引物(包括2條外引物F3、B3，2條內引物FIP、BIP)。引物序列見表1，由擎科生物公司合成。

表1 引物序列

1.3.3 AHSV RT-LAMP反應優化 AHSV RT-LAMP的反應體系為25 μL，依次對dNTP濃度、Mg2+濃度、甜菜堿濃度、引物濃度及溫度進行優化。具體梯度如下：dNTP終濃度為0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol/L；Mg2+終濃度分別為2、4、6、8、10 mmol/L；甜菜堿終濃度分別為0、0.5、1、1.5、2 mol/L；內引物終濃度分別為0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2 μmol/L；外引物終濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 μmol/L，10×Bst buffer 2.5 μL，Bst DNA 聚合酶8 U，模板2 μL，反應溫度優化分別為61℃、62℃、63℃、64℃、65℃，反應時間優化分別為30、45、60、75、90 min。所有體系恒溫反應后，80℃加熱 2 min終止反應。取5 μL反應產物于20 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，以確定最佳的反應體系。添加 SYBR Green Ⅰ染料，并在紫外燈下觀察。

1.3.4 RT-LAMP產物酶切鑒定 用Primer Premier 5軟件分析目的片段的酶切位點，并篩選出具有單一位點的酶EcoRV，預計酶切產物為163 bp和65 bp。20 μL反應體系中含EcoRV 10 U，RT-LAMP 產物5 μL，10×緩沖液2 μL，37℃反應4 h，取8 μL的酶切產物在20 g/L瓊脂糖凝膠中電泳鑒定。

1.3.5 RT-PCR檢測 利用外引物F3、B3進行AHSV RT-PCR擴增，反應體系為25 μL：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，F3、B3各1 μL，模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。按如下程序進行：94℃ 3 min；94℃ 15 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s共34個循環；72℃ 5 min。取5 μL反應產物于20 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，將產物送至華大基因測序鑒定。

1.3.6 RT-LAMP靈敏度檢測 利用Nano Drop 2 000核酸蛋白分析儀對AHSV重組質粒進行定量測定，根據核酸濃度計算質?？截悢礫13]。將AHSV重組質粒進行10倍梯度稀釋，利用的AHSV RT-LAMP和RT-PCR檢測方法，分別對1×106copies/μL～1 copies/μL的DNA進行試驗，對比兩者檢測靈敏度。

1.4 RT-LAMP特異性和重復性試驗

根據建立的AHSV RT-LAMP檢測方法，分別對AHSV、EIAV、JEV、Streptococcus、RV進行特異性試驗。擴增產物經20 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。以AHSV陽性質粒為模板，3次不同時間進行反應，同時設立3次重復，對建立的RT-LAMP檢測方法進行重復性探索及檢測。

2 結果

2.1 AHSV RT-LAMP方法的建立

經過對AHSV RT-LAMP反應體系和條件的優化，最終反應體系為25 μL：外引物F3、B3各0.2 μmol/L；內引物FIP、BIP各1.6 μmol/L；Mg2+6 mmol/L；甜菜堿1 mol/L；dNTP混合液1.2 mmol/L；10×Bst buffer 2.5 μL；Bst DNA 聚合酶8 U；模板2 μL；ddH2O補足25 μL。反應在63℃恒溫反應45 min后，80℃滅活2 min。產物經20 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，可見清晰的階梯狀條帶。在體系反應結束后添加 SYBR Green Ⅰ熒光染料，在紫外燈照下，陰性反應管呈橘紅色，而陽性反應管散發綠色熒光，介于兩者之間的反應管有黃綠色熒光(圖1)。

2.2 RT-LAMP特異性試驗

以AHSV質粒作為陽性對照，檢測馬傳染性貧血病病毒、日本腦炎病毒、鏈球菌、狂犬病病毒進行特異性試驗，驗證所建立RT-LAMP方法的特異性。結果表明，只有AHSV呈陽性，其他試驗樣品呈陰性(圖2)。

2.3 RT-LAMP靈敏度檢測

將AHSV重組質粒進行10倍梯度稀釋，分別對1×106copies/μL～1 copies/μL的DNA進行靈敏度檢測，對比兩者檢測靈敏度。結果表明，用傳統RT-PCR的檢測極限為1×104copies/μL，而用RT-LAMP檢測方法檢測量為1×101copies/μL，RT-LAMP的靈敏度為傳統RT-PCR的1 000倍，RT-PCR目的擴增條帶為228 bp(圖3)。

1.空白對照；2.未優化的反應體系；3.最優反應體系

1.Blank control; 2.Not optimized reaction system; 3.The optimal reaction system

圖1 SYBR GreenⅠ染色結果

Fig.1 Coloration results of SYBR GreenⅠ

2.4 RT-LAMP產物酶切鑒定

RT-LAMP反應產物經EcoRV酶切后，取5 μL反應產物上樣于20 g/L瓊脂糖凝膠電泳(圖4)，可以看到一條163 bp和65 bp的條帶，與理論值相符，說明RT-LAMP 擴增的條帶是AHSV的VP7基因。以F3、B3為外引物，LAMP擴增產物為模板，進行PCR反應，產物測序鑒定后，在NCBI BLAST進行比對，證實擴增序列為AHSV特異性序列。

M.DNA標準DL 2 000；1～5.依次為AHSV、EIAV、JEV、Streptococus、RV樣本；6.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000; 1-5.Simples of AHSV,EIAV,JEV,Stretococus,RV respectively; 6.Blank control

圖2 RT-LAMP特異性檢測

Fig.2 Specificity test for RT-LAMP

M.DNA標準DL 2 000；1～6.樣品依次為106、105、104、103、102、101copies/μL；8～13.樣品依次為106、105、104、103、102、101copies/μL；7、14.陰性對照

M.DNA Marker DL 2 000; 1-7.106,105,104,103,102,101copies/μL samples,respectively; 8-13.106,105,104,103,102,101copies/μL samples,respectively; 7,14.Blank control

圖3靈敏度檢測

Fig.3 Sensitivity test

M.DNA 標準 DL 2 000; 1.RT-LAMP酶切產物

M.DNA Marker DL 2 000; 1.RT-LAMP products digested withEcoRV

圖4 RT-LAMP產物酶切鑒定

Fig.4 Determination of RT-LAMP products digested withEcoRV

3 討論

AHS作為一種高致病性的蟲媒傳染病，能引起馬屬動物皮下組織水腫、肺水腫、內臟出血等癥狀。由于AHS發病迅速，病死率極高，我國將其列為一類動物疫病。各國貿易往來越發頻繁、進出口馬匹越多，此病的傳播就會越發迅速。因此，中國現在雖未發生本病，但建立一種高效、迅速檢測方法的儲備，有利于及時檢測此病病原，將該病拒亡國門之外。

RT-LAMP是一種新型的核酸等溫擴增方法，此方法相比較于RT-PCR有諸多優點。首先，RT-LAMP的擴增效率極高，在短短的15min～60 min內，就能將目的片段擴增109～1010倍，極大程度節省了檢測的時間，對于現場及時檢測具有重大的意義。其次，RT-LAMP檢測方法的靈敏度高，特異性強。就本研究而言，RT-LAMP的靈敏度是傳統RT-PCR的1 000倍；1對外引物和1對內引物保證了擴增時的高特異性。使得檢測的結果更加清晰、準確。再者，結果的檢測簡單，可通過肉眼觀察是否有白色的焦磷酸鎂產生，亦或加入SYBR Green I染料觀察是否有熒光綠，便判斷是否有產物生成，且全程無需復雜的設備。因而，此技術已用于人、動物、植物的多種病原體檢測檢測，具有很高的實用價值。由于RT-LAMP的靈敏度極高，一旦開蓋容易形成氣溶膠污染，加之實驗室并無嚴格分區，假陽性的情況發生較頻繁。所以在操作時應謹慎，切忌把反應后的反應管打開。

本研究發現，針對本套引物，在整個反應體系內Mg2+濃度為6 mmol/L反應條帶最佳，與大多文獻報道最佳Mg2+濃度為8 mmol/L不一致[7,12-13]。內、外引物濃度比值比引物的絕對濃度更重要，本研究濃度比值為8∶1時，擴增的效率最高。這與以往文獻報道的一般選取4∶1或8∶1的內、外引物比值有高擴增效率一致。一般情況下，RT-LAMP在15 min～60 min之內、61℃～65℃之間能觀察到明顯的條帶。本研究在45 min之后才能觀察到條帶，反應溫度以63℃最佳。由此可見，對于不同的引物和模板，反應體系各組分的最佳濃度、反應最短時間以及最適溫度也會隨之改變。因此，優化一個反應體系，對于建立某種病毒最理想的檢測方法是必不可少的。

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2017-03-28

“十二五”國家科技支撐計劃項目(2013BADl2804)

姜睿姣(1996-)，女，四川雅安人，本科生，主要從事動物傳染病病原微生物及其分子生物學研究。*

S852.65

A

1007-5038(2017)12-0001-05