乳腺癌患者新輔助化療前后Topo Ⅱ蛋白變化及其對術后化療方案的指導意義

李文祥 魏 瑾 胡森焱 荀 江 馬 平 洪靈芝 龔建平

乳腺癌患者新輔助化療前后Topo Ⅱ蛋白變化及其對術后化療方案的指導意義

李文祥 魏 瑾 胡森焱 荀 江 馬 平 洪靈芝 龔建平

目的研究乳腺癌新輔助化療前后Topo Ⅱα陽性表達及其對術后化療方案選擇的指導作用。方法對TNM分期Ⅱb及以上的乳腺癌患者行新輔助化療治療后，適合手術的患者行保乳手術治療。免疫組化法測定新輔助化療前后的Topo Ⅱα陽性表達，對比化療前后、不同化療方案化療后的陽性表達情況，記錄對比Topo Ⅱα陽性表達和陰性表達患者的術后療效。結果CMF方案化療前后的Topo Ⅱα陽性表達率差異無統計學意義(P>0.05)；EC方案化療后Topo Ⅱα陽性表達率顯著高于化療前(P<0.05)，且顯著高于CMF方案組(χ2=4.219，P=0.040<0.05)；ECT方案化療后Topo Ⅱα陽性表達率顯著高于化療前(P<0.05)，且顯著高于CMF方案組(χ2=6.522，P=0.011<0.05)。EC方案組和ECT方案組化療后，Topo Ⅱα陽性表達無統計學差異(χ2=0.269，P=0.604>0.05)?；熐癟opo Ⅱα陽性表達的患者，CR+PR率、中位TTF顯著高于陰性表達的患者(P<0.05)，腋窩淋巴結轉移低于陰性表達的患者(P<0.05)。結論含蒽環類藥物的化療方案具有促進Topo Ⅱα陽性表達，提高術后療效的作用，在術后輔助化療方案中可以添加蒽環類藥物，增加化療敏感性。

新輔助化療；Topo Ⅱα；術后化療

在影響女性生命健康的惡性腫瘤中，乳腺癌發病率最高，占所有女性惡性腫瘤的7%～10%，且近年來呈現逐年上升的趨勢，并呈現年輕化趨勢。乳腺癌作為一種全身性疾病，在早期即可發生全身擴散，對其治療應采用全身治療和局部治療相結合的綜合治療方法。新輔助化療作為乳腺癌綜合治療的重要組成部分，逐漸被重視，由于腫瘤細胞多藥耐藥的存在，往往導致化療失敗，因此，研究腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性和敏感性是新輔助化療的目的之一。Topo Ⅱ是大多數蒽環類藥物的作用靶點，對預測腫瘤細胞耐藥性和敏感性具有重要意義。本文測定接受新輔助化療前后乳腺癌患者Topo Ⅱ蛋白變化，并研究其對術后化療方案的選擇的指導意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇2013年5月至2016年5月，選取我院和南京醫科大學附屬南京醫院與江蘇省腫瘤醫院就診的乳腺癌女性患者103例，所有患者均經病理檢查確診，年齡23～74歲，年齡中位數為45.2歲。淋巴結轉移陽性患者68例，淋巴結轉移陰性患者35例；腫瘤>5 cm患者27例，>2～5 cm患者65例，≤2 cm的患者11例；TNM分期Ⅱb期及以上52例。所有患者均未接受過任何放療、化療或手術治療，無合并其他腫瘤。

1.2 方法

1.2.1 試劑一抗 鼠抗人Topo Ⅱα單克隆抗體、SP染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；其他試劑購自福州邁新生物技術有限公司。

1.2.2 Topo Ⅱα蛋白的免疫組化法測定 所有組織標本修剪后，用10%福爾馬林溶液固定，清洗、脫水、透明后，石蠟包埋，保持4 μm厚連續切片，烘片。石蠟切片脫蠟、脫水、清洗，高溫修復冷卻至室溫后，清洗，并加入一抗，4 ℃孵育24 h后，取出，清洗，加入二抗，于37 ℃下孵育30 min，DAB顯色、沖洗后，蘇木精復染，沖洗、脫水，干燥后封片。于10×40高倍顯微鏡下觀察。陰性對照組用正常PBS代替一抗，其他步驟均相同。操作過程嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.3 結果判讀 Topo Ⅱα蛋白表達陽性判讀：所有乳腺癌標本染色后，由3位以上病理醫師通過雙盲法進行讀片，最后討論統一。Topo Ⅱα染色位于細胞核，表現為清晰棕黃色或棕褐色。于高倍顯微鏡下觀察切片，每個切片隨機選取5個視野進行結果判定。陽性細胞(核染色強度為+++)比例>10%為陽性；或陽性細胞(核染色強度為++)比例≥50%為陽性。

1.2.4 化療方法 患者化療前血常規、肝腎功能及心電圖檢查均正常。采用隨機數表法，將TNM分期Ⅱb及以上患者分為3組，分別給予新輔助化療：CMF方案組(環磷酰胺600 mg/m2、甲氨蝶呤40 mg/m2、5-氟尿嘧啶600 mg/m2)、EC方案組(表柔比星60 mg/m2、環磷酰胺600 mg/m2)、ECT方案組(表柔比星60 mg/m2、環磷酰胺600 mg/m2、紫杉醇200/m2)。3組一般臨床資料相比，差異無統計學意義(P>0.05)，具有臨床可比性。見表1?；?個周期后，對于適合保乳手術治療的患者行保乳手術治療。分別于新輔助化療前后，粗針穿刺取得患者腫瘤組織標本，測定Topo Ⅱα，統計陽性表達數。

1.2.5 療效評價 療效評價按照世界衛生組織統一標準進行評價，完全緩解(CR)+部分緩解(PR)為有效；療效持續時間(TTP)：從本次治療開始到腫瘤進展的時間，TTF：治療開始到病變進展時間，包含任何原因中斷治療日期為止。

1.3 數據處理

所有臨床和實驗數據采用SPSS 19.0進行數據處理。計數資料以例表示，前后比較采用卡方檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 新輔助化療前后Topo Ⅱα陽性表達對比

3組化療前，Topo Ⅱα陽性表達例數無統計學差異(P>0.05)。CMF方案組化療前后對比，Topo Ⅱα陽性表達差異無統計學意義(P>0.05)。EC方案組，Topo Ⅱα陽性表達，化療前后差異有統計學意義(P<0.05)；化療后陽性表達例數顯著增加，與CMF組相比，差異有統計學意義(χ2=4.219，P=0.040<0.05)。ECT方案組，Topo Ⅱα陽性表達化療前后差異有統計學意義(P<0.05)；化療后陽性表達例數顯著增加，與CMF方案組相比，差異有統計學意義(χ2=6.522，P=0.011<0.05)。EC方案組和ECT方案組，化療后，Topo Ⅱα陽性表達無統計學差異(χ2=0.269，P=0.604>0.05)。見表2。

2.2 化療前Topo Ⅱα陽性表達與臨床療效、預后及遠處轉移的關系

化療前Topo Ⅱα陽性表達的患者，CR+PR率、中位TTF顯著高于陰性表達的患者(P<0.05)，腋窩淋巴結轉移低于陰性表達的患者(P<0.05)。見表3。

3 討論

表1 3組一般臨床資料對比/例

表2 3組新輔助化療前后Topo Ⅱα陽性表達對比/例

表3 化療前Topo Ⅱα陽性表達與臨床療效、預后及遠處轉移的關系

注：*為與Topo Ⅱα陰性比較，P<0.05。

新輔助化療(neoadjuvant chemotherapy,NACT)又稱術前化療、誘導化療和首次化療，是指對肺轉移性腫瘤在局部手術或放療前，應用全身性、系統性的細胞毒藥物進行治療[1-2]。

隨著循征醫學的發展，個體化化療逐漸應用于乳腺癌的治療。新輔助化療作為個體化化療的第一步，一方面可以降低局部晚期乳腺癌分期，縮小原發腫瘤，提高早期乳腺癌患者保乳手術的成功率[3]；另一方面控制和殺滅全身微轉移癌、亞臨床擴散病灶[4]；其次，作為體內化療敏感試驗，了解癌細胞對化療藥物的敏感度和耐藥性，為術后化療方案的選擇提供指導[5-7]。雌激素受體(estrogen receptor,ER)/孕激素受體(progesterone receptor,PR)[8]、Bcl-2凋亡基因[9]、HER-2基因[10-11]、Ki-67[12-14]是目前研究較多的新輔助化療療效預測因子。

DNA作為遺傳物質，在細胞生長及新陳代謝過程中起到至關重要作用。腫瘤的發生發展過程涉及到DNA的結構變化和修復。近年來，拓撲異構酶Ⅱα(topoisomerase Ⅱα,Topo Ⅱα)用于新輔助化療療效評估逐漸受到重視。TopoⅡα是原發性腫瘤細胞增殖的標志物，與腫瘤級別的增高成正相關關系。Topo Ⅱα是一種基本的細胞核酶，其編碼基因位于染色體17q21-22，具有改變DNA拓撲學結構的作用，其表達具有細胞周期依賴性的特點，通常在S期表達最多，在DNA的合成、轉錄、核分裂及染色體結構形成、分離和濃縮過程具有重要作用[15-16]。位于二聚體酶2個亞基上的酪氨酸，在其殘基間的酯基轉移作用下，Topo Ⅱα剪切并打開DNA雙鏈，使DNA雙螺旋松弛，雙螺旋缺口增大，缺口在第二股DNA雙螺旋通過后關閉，Topo Ⅱ與DNA鏈之間的共價連接被撤銷，DNA雙螺旋結構被擰緊而恢復結構，在細胞分裂間期核基質、有絲分裂期染色體配對、染色體分離、基因重組和轉錄及修復等過程緊密聯系[17]。研究顯示，Topo Ⅱα是許多細胞毒藥物的作用靶點，主要有蒽環類、鬼臼堿類、蒽醌類等[18]。其耐藥機制表現為以下三個方面：①Topo活性降低；②磷酸化水平增加；③基因點突變或缺失，導致細胞毒藥物不能與該酶結合，抑制DNA斷裂，引起耐藥。Topo Ⅱα表達下調或性質改變，形成DNA酶易解離復合物，降低化療藥物的敏感性，活性或含量的降低，最終導致腫瘤細胞耐藥的產生。肖海風等[19]研究發現，蒽環類化療藥物對Topo Ⅱα陽性表達者的效率是陰性表達者的3.077倍，Topo Ⅱα表達降低嚴重影響蒽環類藥物化療的敏感性。帥萍[20]在乳腺癌組織中Topo Ⅱα的研究中發現，Topo Ⅱα基因的擴增可以有效改善蒽環類化療藥物輔助治療效果。本文研究了不同新輔助化療方案治療前后的乳腺癌患者Topo Ⅱα變化，結果顯示：3種化療方案化療前，Topo Ⅱα陽性表達率無統計學差異(P>0.05)，化療后EC方案組及ECT方案組Topo Ⅱα陽性表達率顯著高于CMF方案組，而EC方案組和ECT方案組化療后Topo Ⅱα陽性表達無統計學差異。在對Topo Ⅱα陽性表達和陰性表達患者的療效研究中，發現陽性表達的患者的有效率、中位TTF和腋窩淋巴結轉移顯著高于陰性表達的患者(P<0.05)，說明Topo Ⅱα陽性表達的患者對化療藥物，尤其是蒽環類藥物的敏感性較高，提示我們在術后輔助化療中，對陽性表達的患者應用含蒽環類藥物的化療方案可以有效改善患者的療效。

綜上所述，含蒽環類化療方案的新輔助方案化療后，患者Topo Ⅱα陽性表達顯著增加，有利于提高患者術后的療效。對于新輔助化療后患者Topo Ⅱα陽性表達顯著增加的患者，為了提高術后輔助化療藥物的敏感性，提高療效，可以選用含蒽環類藥物。

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ChangesofTopo-ⅡProteininPatientswithBreastCancerbeforeandafterNeoadjuvantChemotherapyandItsGuidingSignificanceforPostoperativeChemotherapy

LIWenxiang,WEIJin,HUSenyan,etal.

GaochunPeople’sHospital，Nanjing,211302

ObjectiveTo study the expression of Topo Ⅱα in breast cancer patients before and after neoadjuvant chemotherapy and its guiding significance in the selection of postoperative chemotherapy.MethodsBreast cancer patients with stage Ⅱb and above were treated with neoadjuvant chemotherapy.Patients who suit for surgery were treated with breast conserving surgery.The expression of Topo Ⅱα before and after neoadjuvant chemotherapy were detected by immunohistochemistry.Compared the positive expression of Topo Ⅱα before and after neoadjuvant chemotherapy and the effect between patients with positive and negative expression of Topo Ⅱα.ResultsThe expression of Topo Ⅱα in CMF regimen before and after chemotherapy was not statistically significant (P>0.05).The number of positive expression patients accepted EC chemotherapy was significantly higher than that before chemotherapy (P<0.05) and was significantly higher than that of CMF (χ2=4.219,P=0.040<0.05).The number of positive expression patients accepted ECT chemotherapy was significantly higher than that before chemotherapy (χ2=6.522,P=0.011<0.05).There was no significant difference between EC and ECT group in the positive expression of Topo Ⅱα(χ2=0.269,P=0.604>0.05).The CR+PR rate,median TTF were significantly higher in patients with Topo Ⅱα positive expression than those with negative expression (P<0.05)，axillary lymph node metastasis was lower(P<0.05).ConclusionChemotherapy regimen containing anthracycline can increase the expression of Topo Ⅱα and improve the curative effect.The anthracyclines can be added to the postoperative adjuvant chemotherapy regimen to increase the chemosensitivity.

Neoadjuvant chemotherapy;Topo Ⅱα;Postoperative chemotherapy

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1918～1921)

江蘇省南京市衛生局科技項目(編號:YKK12175)

211302 江蘇省南京市高淳人民醫院(李文祥，魏 瑾，胡森焱，荀 江，馬 平)；210029 南京醫科大學附屬南京醫院(洪靈芝)；210009 江蘇省腫瘤醫院(龔建平)

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.12.002

R737.9

A

1001-5930(2017)12-1918-04

2017-02-24

2017-10-25)

(編輯：甘艷)