不同梯度NaCl脅迫對甜高粱幼苗抗氧化同工酶亞基及酶活性的影響

趙會君++李歡++劉海波

摘要： 以甜高粱品種M-81E為材料，采用水培的方法，研究鹽濃度為0、25、50、100mmol/L的脅迫處理對甜高粱幼苗抗氧化酶[超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）]同工酶亞基、酶活性以及葉片中丙二醛含量的影響。結果表明：不同濃度的鹽脅迫對甜高粱幼苗葉片中SOD、POD、CAT、APX活性的影響程度不同，SOD活性隨著鹽脅迫時間的延長和濃度的增大在一定范圍內降低，而POD、CAT、APX活性卻在一定范圍內顯著升高，表現為同工酶亞基條帶增多或者亮度增強。甜高粱幼苗葉片丙二醛含量隨著脅迫時間的延長有上升趨勢，但不顯著。由研究結果可知，鹽脅迫對甜高粱的抗氧化酶系統進行了修飾，導致SOD活性下降，因此SOD并沒有起到清除過氧化物的作用，而CAT、APX和POD在甜高粱耐受鹽堿脅迫中起到重要的保護作用。

關鍵詞： 甜高粱；鹽脅迫；同工酶；抗氧化酶系統；丙二醛

中圖分類號： Q554；S514.01 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）22-0089-05

寧夏地處西北內陸，有大面積待開發的鹽堿化土地，僅銀川北部的鹽堿化土地面積已經達到總耕地面積的49%，這已經成為寧夏農業生產的重要影響因素之一[1]。因此，篩選適合鹽堿地種植的作物，充分開發利用鹽堿地，對于當地的經濟發展和農業生產有著重要的意義。甜高粱別稱糖高粱、蘆粟、甜稈等，是禾本科高粱屬一年生草本植物，為普通粒用高粱的變種，具有抗旱、耐澇、耐鹽堿、適應性強、生物產量高、糖分含量高等特點，對土壤的適應能力很強，是名副其實的高效能植物[2-3]。再吐尼古麗·庫爾班等對甜高粱改良鹽堿地的效果進行研究，結果表明，種植甜高粱后對鹽堿地有非常明顯的脫鹽效果，種植過程中土壤鹽分含量逐漸降低，土壤養分含量也發生明顯的變化，其中pH值輕度降低[4]。隨著我國出臺的《中國可再生能源中長期發展規劃》的推行，大力發展鹽堿地甜高粱等非糧生物質能源作物的種植，對鹽堿化土地的有效利用以及能源危機的緩解有重大意義。

當遭受鹽堿脅迫時，植物體內會累積較多的活性氧，若不能及時清除就會使膜系統受到損傷，對植物體造成不同程度的傷害甚至死亡。龔明等對鹽脅迫下大麥、小麥等葉片脂質過氧化傷害與超微結構的變化研究發現，鹽分可以增加膜的透性，增強脂質過氧化作用，最終導致膜系統破壞[5]。鹽生植物或耐鹽植物在鹽堿脅迫下膜系統的變化過程是先被破壞，然后被修復。植物能否維持其膜系統的完整性，關鍵在于其修復能力大小，而膜系統的修復與 超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）的活性高低是分不開的。SOD、POD、CAT及APX是植物體內的抗氧化酶系統，它們相互協調、共同作用來清除膜脂過氧化作用產生的活性氧和丙二醛，最終達到保護膜結構的作用[6]，抗氧化系統的協調作用使活性氧簇（ROS）在體內維持較低水平，從而使植物能進行正常生長和發育。

因此，本試驗以甜高粱品種M-81E為材料，研究不同濃度的鹽脅迫對抗氧化酶SOD、POD、CAT、APX活性以及同工酶亞基、丙二醛（MDA）含量等生理指標的影響，以探討甜高粱苗期耐鹽的生理機制，對甜高粱的適地種植有重要的指導意義，也為開發利用鹽堿地發展生物質能源提供品種資源和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試甜高粱品種為M-81E，由北方民族大學植物生理實驗室提供，選取當年產的籽粒飽滿、大小均勻的種子備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 幼苗培養及處理 種子用自來水反復沖洗后用10%次氯酸鈉消毒10 min，常溫下用滅菌水沖洗并浸泡8 h，擺放在鋪有2層濾紙的培養皿中，置于27 ℃恒溫生化培養箱內催芽。等芽長約為3.0 cm時，置于28 ℃光照培養箱內進行光照培養。待苗高約為5cm時，轉至自然光條件下用Hoagland營養液培養，每周更換1次培養液。

待甜高粱幼苗長到3葉1心時，將幼苗隨機分組，設置0、25、50、100 mmol/L 4個NaCl處理梯度，每個處理設3個重復，于處理后的第2天取葉片提取可溶性總蛋白，用于同工酶電泳檢測，于處理后第3、6、12、18天稱取成熟葉片0.5 g，用于測定SOD、POD、CAT、APX活性以及丙二醛含量（鮮質量）。

1.2.2 酶液的提取及同工酶電泳 取處理第2天的0.5 g新鮮成熟葉片，加入5 mL冰上預冷的50 mmol/L磷酸緩沖液（pH值7.0），于冰浴中研磨，4 ℃、12 000 g離心20 min，收集上清液，即為酶粗提液?？扇苄钥偟鞍缀康臏y定采用考馬斯亮藍法。同工酶電泳采用北京市六一儀器廠生產的垂直板凝膠電泳儀，電泳時SOD、POD、CAT采用10%分離膠、5%濃縮膠，APX采用7.5%分離膠、5%濃縮膠，上樣量35 μL，預電泳10 min，濃縮膠中穩定電壓為80 V，進入分離膠后穩定電壓為120 V，電流為200 mA。于冰浴中電泳3～4 h，當指示染料下行至距膠板末端1～2 cm時停止電泳。

SOD同工酶采用氮藍四唑法染色[7]，POD同工酶采用醋酸-聯苯胺法染色[8]，CAT采用淀粉法染色[9]，APX參照邵巍等的方法染色[10]。根據染色的酶譜計算相對遷移率Rf（Rf=酶帶遷移距離/前沿指示劑距離）。

1.2.3 酶液的提取及酶活測定 分別取處理3、6、12、18 d的成熟葉片0.5 g，酶液提取方法及可溶性總蛋白含量測定方法同“1.2.2”節，SOD活性測定采用氮藍四唑（NBT）法[11]，POD活性測定采用愈創木酚法[11]。CAT、APX活性的測定采用吳倩等的方法[12-13]。每個處理重復3次，所得數據用Graph Padprism 5.0統計軟件分析。

2 結果與分析

2.1 脅迫早期過氧化物同工酶電泳結果

由圖1的CAT同工酶染色檢測結果看出，與對照相比，當受到鹽脅迫時，CAT出現明顯的2條帶，并且亮度、酶帶寬度明顯增加，這暗示CAT同工酶基因受到鹽脅迫的誘導，表達產物增加。與此同時，檢測SOD的同工酶條帶，結果表明，隨著鹽脅迫濃度的增加，SOD的S1亞基條帶消失，S2、S3亞基條帶亮度減弱，這暗示高濃度的鹽脅迫抑制了SOD基因的表達。隨著鹽濃度的增加，在短時間內APX的A3條帶亮度也逐漸增加，并且出現1條較為模糊的條帶A2，這也顯示相關基因受到鹽脅迫誘導。POD染色結果顯示，在短時間處理下，POD同工酶出現6條比較明顯的條帶，這6條帶的亮度都隨著脅迫濃度的增加而加深，尤其是P1、P2條帶亮度和寬度增加比較明顯，表明這2個亞基基因對NaCl脅迫更加敏感，能在短時間內受到鹽脅迫的誘導。

2.2 不同處理濃度和時間下4種抗氧化酶的活性

2.2.1 不同處理濃度和時間下SOD活性的變化 SOD是重要的抗氧化酶，能夠清除活性氧從而防止H2O2的生成，其活性的高低能反映植物耐受逆境環境的能力。在本試驗中發現，脅迫初期，低濃度的鹽脅迫在一定程度上能夠刺激SOD活性增強，由圖2可見，隨著脅迫時間的延長和濃度的增大，SOD處于被抑制狀態，尤其是第18天，對SOD的抑制達到顯著水平（P<0.05），通過同工酶電泳試驗也證實了這一結論，說明在高濃度的鹽脅迫下，SOD并沒有起到抗氧化保護作用，可能因為鹽脅迫產生的過氧化產物為H2O2。

2.2.2 不同處理濃度和實踐下POD的活性 POD是植物體內清除H2O2的重要抗氧化酶之一，也是植物受到傷害的重要指標。從圖3可以看出，隨著脅迫時間的延長，高濃度的鹽脅迫都會使POD的酶活性顯著升高，在處理第3天，100 mmol/L NaCl使POD活性極顯著升高（P<0.01），而在處理第6天，25、50、100 mmol/L NaCl使POD活性極顯著升高（P<0.01或P<0.001），說明POD活性的急劇上升，是甜高粱耐受鹽堿脅迫的重要標志，POD也是參與清除過氧化物質的重要抗氧化酶之一。

2.2.3 不同處理濃度和時間下CAT的活性 由圖4可見，與對照相比，當遭受鹽堿脅迫后的第3天，CAT活性開始上升但變化不顯著，隨著處理時間的延長，CAT活性隨鹽濃度的升高不斷上升，處理第6天發現，不同濃度NaCl使CAT活性與對照的差異達到了極顯著水平（P<0.01），這一顯著上升現象一直持續到處理的第18天。

2.2.4 不同處理濃度和時間下APX的活性變化 由圖5可見，在50、100 mmol/L NaCl處理第3天，APX活性與對照相比 [CM（25]達到極顯著差異（P<0.01、P<0.001）。 處理第18天，3個處理都使APX活性顯著升高。由于APX具有清除H2O2的能力，APX活性的極顯著升高說明鹽堿脅迫導致甜高粱體內產生了較多的H2O2，提示APX對甜高粱的過氧化物清除起到重要作用。

2.3 不同處理濃度和天數下葉片中MDA含量

MDA是植物體內脂質過氧化的產物，其含量越高表明受氧化損傷的程度越大。圖6結果顯示，在脅迫第3天，25、50 mmol/L NaCl脅迫并沒有使甜高粱體內的MDA含量上升，相反，100 mmol/L NaCl脅迫處理卻使MDA含量極顯著下降（P<0.01）；在處理的第6天、第12天，MDA含量都沒有顯著改變，在處理的第18天，100 mmol/L NaCl卻使MDA含量顯著上升（P<0.05）。分析其原因，可能是在脅迫早期，隨著鹽濃度升高，甜高粱體內抗氧化酶活性升高，從而使脂質過氧化程度降低，MDA含量也降低，當脅迫時間延長以及SOD被顯著抑制，導致H2O2不能及時被清除，因此對細胞膜造成損傷，使MDA含量升高。

3 討論

關于鹽脅迫對植物的傷害機制的研究已有較多報道，主要表現在形態、生理生化指標的改變等方面[14]。孫方行等對刺槐進行3、17 d鹽脅迫處理后發現，MDA含量和細胞膜透性存在極顯著正相關關系，葉綠素濃度和可溶性蛋白含量也存在極顯著相關關系，SOD活性和葉綠素濃度呈負相關[15]。吳成龍等對堿脅迫對菊芋幼苗生長及其光合作用、抗氧化作用的影響進行研究得出：在0.2%Na2CO3脅迫下，菊芋葉片SOD、POD和CAT活性均比正常生長條件下的增強[16]。植物耐受鹽堿脅迫的主要過程就是減輕脂質過氧化作用和增強抗氧化物酶保護作用，SOD具有特殊的生理活性，是生物體內清除自由基的首要物質，有研究表明，植物的抗逆能力與SOD活性的高低有顯著的相關性，而在本試驗中發現，隨著鹽濃度的增加以及處理時間的延長，SOD同工酶亞基處于被抑制狀態，活性下降，此結論與姜慧等關于鹽脅迫對甜高粱幼苗抗氧化酶活性影響的研究結果[17]一致，表明在甜高粱耐受鹽脅迫過程中SOD并沒有起到主要的抗氧化保護作用，因此體內的H2O2物質可能是氧化損傷的主要物質之一。POD是植物體內活性較高的酶，一般在幼嫩的組織中活性較低，在老化的組織中活性較高，能夠反映植物生長發育的特性、體內代謝狀況以及對外界環境的適應性。在本試驗中，POD酶亞基在脅迫早期電泳條帶亮度就已經明顯提高，可見其酶活性呈明顯升高趨勢，說明POD在甜高粱耐受鹽脅迫的過程中起到抗氧化保護作用。CAT可促使H2O2分解為分子氧和水，起到清除體內的過氧化氫的作用，從而使細胞免于遭受H2O2的毒害。在本試驗中，由于CAT酶亞基脅迫早期條帶數、亮度就增加，整個脅迫過程中酶活性都呈增加趨勢，這使甜高粱體內的H2O2得到及時的清除，此試驗結果與吳倩的研究結果[12]相似。APX是一種含銅的酶，能催化抗壞血酸（ASA）氧化，具有抗衰老等功能，在植物體內的物質代謝中起重要作用。POD、CAT、APX等酶活性的顯著或極顯著上升，對于清除這些過氧化物質起到重要的作用。因此可見，鹽脅迫改變了甜高粱抗氧化酶系統的活性。