作物病原真菌的拮抗菌篩選及其活性物質初步鑒定

胡洪濤+張亞妮+張舒+李金泉+張佑宏+汪本福+曹春霞+任淑惠+朱志剛+姚經武+龍同+黃大野+楊自文

摘要：從湖北、安徽等地的水稻、小麥、豇豆、西瓜等種植區采集土壤，進行了微生物分離和培養。采用對峙培養法，篩選到20株對11種重要作物病原真菌，如水稻稻瘟菌、小麥赤霉菌、豇豆根腐菌、西瓜枯萎菌等，具有不同拮抗活性的細菌，其中2株具有廣譜抗真菌活性。利用高效液相色譜和質譜對其中一株菌株的代謝產物進行了制備和結構初步鑒定，發現其主要活性成分為多烯類物質，分子量為803.67。繼續深入研究抗菌物質結構和抑菌機理，將有助于新型生物源殺菌劑的開發。

關鍵詞：生防菌；稻瘟菌；赤霉菌；抑菌活性；高效液相色譜；質譜

中圖分類號：S476

文獻標識碼：A 文章編號：1674-9944（2017）23-0164-04

1 引言

作物真菌性病害，如水稻稻瘟?。≧ice blast）、小麥赤霉?。‵usarium head blight）、西瓜枯萎?。‵usarium wilt of watermelon）、豇豆根腐?。–owpea root rot）等，是世界性重要作物病害，全球每年僅因稻瘟病和赤霉病流行導致的經濟損失就高達數十億美元^[1，3]，同時，赤霉菌所產生的真菌毒素嚴重威脅著食品安全^[4]；西瓜枯萎病和豇豆根腐病是重要土傳性病害，常導致西瓜和豇豆大面積死亡。目前，防治真菌性病害的方法眾多，但多以化學藥劑防效最好，然而，化學藥劑大量施用，不僅導致農藥殘留超標，也給環境和食品安全帶來極大隱患。生物農藥環境兼容性好、對生物安全，是作物病害綠色防控技術體系的關鍵。供藥篩選的化合物主要由3種獲取途徑，購買已知化合物庫、分離和提取天然產物以及化學合成，其中微生物來源的天然產物因其種類眾多、易擴大和再生，而成為藥物開發的最主要來源^[5]。由于前人研究多關注放線菌和真菌，因而在過去所發現的2萬多種微生物來源的活性物質中，絕大部分來源于放線菌和真菌^[5]，只有小部分約7%來源于細菌，說明細菌來源的活性物質亟待研究和開發。目前，針對作物真菌病害的生物防治研究，多限于微生物本身，很少涉及到微生物代謝產物，對其活性成分研究更少^[6]。通過在大田采取土樣，進行細菌分離、純化，對具有較好拮抗作用的菌株進行大量發酵，并提取其代謝產物，利用高效液相色譜和液質聯用儀進行化合物制備和結構初步鑒定，為開發新型生物源農藥奠定基礎。

2 材料與方法

2.1 供試作物病原真菌

稻瘟菌（Magnaporthe grisea）為湖北省農業科學院植保土肥所研究所提供，小麥赤霉菌（Fusarium graminearum）、茄科立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、棉黃萎菌（Verticillium dahliae）、柑橘褐腐（Fusarium spp.）、柑橘黑腐菌（未定種）、柑橘綠霉（Penicillium digitatum）、柑橘青霉（Penicillium italicum）、豇豆根腐菌（Fusarium solani）、西瓜枯萎菌（Fusarium oxsporum）為湖北省生物農藥工程研究中心生物防控研究室分離和保存。

2.2 土壤細菌分離

用于分離土壤細菌的土壤，2016年采集于湖北武漢和宜城，及安徽銅陵等地水稻、小麥、豇豆、西瓜等大田，采用稀釋法進行土壤細菌分離。首先，稱取1.0 g 左右土壤，放入裝有玻璃珠的消毒三角瓶，然后，加入100 mL 無菌水，置于搖床（28 ℃，150 r/min）振蕩15 min，采用倍比稀釋法進行稀釋，每個濃度取100 μL，用涂布棒在NA平板上均勻涂布，置于28 ℃培養箱進行培養24～48 h，挑取單菌落進行二次劃線純化，經鏡檢無雜菌后，-80 ℃保存于25%甘油管中。

2.3 作物病原真菌拮抗菌初篩

將供試保存的病原真菌在真菌培養基上活化3～5 d，用直徑為5 mm 打孔器沿菌落邊緣打成菌絲塊，將菌絲塊轉移至新真菌培養基平板中央，然后，將待測細菌接種于離菌絲塊15 mm 左右的地方，于26 ℃培養3～5 d后，測量和記錄抑菌圈大小。

2.4 拮抗菌代謝產物提取

拮抗細菌在NA平板上活化24 h，接種于NA液體培養基的帶擋板的500 mL三角瓶，每瓶培養基體積為50 mL，共接種20瓶，搖床振蕩（28 ℃，150 r/min）培養48 h后，每瓶加入等體積的乙酸乙酯，搖床振蕩（28 ℃，150 r/min）2 h，然后，靜置直至完全分層。將上清小心吸出，采用旋轉蒸發儀（45 ℃，100 Pa）將其蒸干，產物用甲醇溶解后，用于高效液相色譜（HPLC）制備和液質聯用儀（LC-MASS）分析。

2.5 代謝產物HPLC制備

采用高效制備液相色譜儀（Waters2525泵，帶2767自動收集系統，2996二級管陣列檢測器，色譜工作站MasslynxV4.0）進行拮抗菌代謝產物制備。色譜柱為美國SunfireOBD C18 Prep 柱，250×19 mm（i.d），粒徑10 μm；柱溫為室溫；流動相：A為 水，B為乙腈（梯度洗脫）；進樣量為3000 μL；流速為27 mL/min； 檢測條件：PDA全波長掃描。

進樣體積為1000 μL，柱溫為室溫，流速為24 mL/min，流動相為乙腈和水，采用表1梯度洗脫，乙腈的濃度在 25 min內由5%變至100%。每0.5 min收集一個組份，用干凈空氣吹干后進行生物活性測定，確定活性成分分布位置（表1）。

2.6 活性物質LC-MASS分析

高效液相色譜-質譜聯用儀為Waters 2695高效液相色譜系統，美國Micromass Quattro micro質譜儀（電噴霧離子源（ESI）），Masslynx V4.1液質聯用分析軟件。質譜檢測條件：電噴霧電離（ESI），毛細管電壓為3.5 kV，錐孔電壓為45 V，離子源溫度為100 ℃，脫溶劑氣溫度為 300 ℃，脫溶劑氣體流速500 L/h，錐孔氣體流速為50 L/h。endprint