呼吸道疾病與細菌組學

孔憶秋， 李 言， 張 永

1 背景

在醫學領域，隨著高通量測序等生物技術的發展，人們越來越認識到在人體體表和腸腔器官擁有豐富的微生物群落——微生物組，參與人體免疫調節、食物消化、維生素合成等一系列生命活動。而眾多疾病的發病機制涉及到微生物群落的組成和行為的改變，如胃腸道炎癥性疾病、AIDS相關的機會性感染、呼吸系統疾病、某些腫瘤等。人體微生物組擁有數量驚人的微生物數量（人體細胞數量10倍之多）及基因數量（人體基因的100多倍）。目前，微生物組與臨床疾病研究主要集中在炎癥性腸病、糖尿病、過敏性疾病等。隨著非培養生物分子生物技術等發展，人們認識到健康的肺部并非無菌，而呼吸道的微生物組群與多種呼吸道疾病有著特殊的關聯。

2 微生物組研究方法

分離培養是研究微生物的傳統檢測和鑒定方法，但是人體和環境中絕大多數的微生物并不能通過該傳統方法獲得。因此，以高通量測序為代表的非培養分子生物技術逐漸成為目前研究微生物組的標準方法。該技術通過對樣本中微生物的用于系統分類標記的DNA序列[細菌和古生菌的16S rRNA、真菌的內轉錄間隔區（ITS）等]進行測定獲取海量基因序列信息，并通過多種復雜的生物信息學統計分析，可以進行物種鑒定，從而揭示環境和人體微生物種群的相對豐度、進化關系或系統分類[1]。16S rRNA基因測序已成為目前細菌群落研究最常用的方法[2]。16S rRNA基因數據庫目前正飛速增加，為微生物鑒定和微生物群落研究提供了有力的數據支持。隨著非培養分子技術等微生物組研究方法的進步與應用，人體微生物組海量的多樣性和高度的個體性才得以全面展示并深刻改變了人們的認識。

3 呼吸道特征及環境

傳統“肺內無菌”的觀念是基于健康人群支氣管肺泡灌洗液（ΒALF）和痰液的陰性培養結果得出的[3]。但這種觀念最早由Hilty等[4]提出質疑。事實上，越來越多的研究證實健康人群呼吸道微生物組的多樣性和復雜性[5-6]。

3.1 健康呼吸道細菌組特點

關于健康人體肺部微生物組的主要微生物組成大體是一致的。2010年，Hilty等[4]首次將高通量測序技術應用于健康受試者ΒALF中細菌檢測，他們發現：①健康人上、下呼吸道都存在相近的菌群；②呼吸系統疾病可以改變菌群種類，如慢性阻塞性肺疾?。–OPD）患者呼吸道內變形菌綱（Proteobacteriae）的豐度增加。其他研究也不斷發現并證實呼吸道擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（F i r m i c u t e s）、普雷沃菌屬（Prevotella）、韋榮球菌屬（Veillonella）、鏈球菌屬（Streptococcus）等優勢菌群[5，7]。這些肺部菌群更接近于口咽菌群[7]，推測與食管反流、喉功能性障礙，或者口腔衛生相關。放射性示蹤研究表明，即使健康人群也會發生睡眠中微量誤吸現象[8]，尤其當平臥和咳嗽反射抑制時[9]。此外，肺微生物組成還可能存在晝夜節律或區域差異[10]。

3.2 肺炎

肺炎是遠端氣道、肺泡和肺間質的感染性炎癥。Dickson等[11]對比ΒALF傳統的定量培養和非培養的基因測序，結果發現兩者在細菌負荷、群落多樣性等變化高度一致。因此，ΒALF基因測序可以確定肺炎患者肺泡中存在細菌的種類[12-13]，責任病原菌種類一般占檢測序列的75%以上。傳統的肺炎發病模型是：某種致病菌入侵無菌的健康肺臟，打破了局部的防御能力，呼吸道內不斷生長導致肺炎的發生。但肺臟微生物組的發現逐漸顛覆了我們對肺炎發病機制的認知[14]：健康的下呼吸道由多種微生物——其中包括潛在的致病菌——組成動態穩定的生態系統，肺炎的發生也不是病原體入侵進入肺部引起，而是微生物種群在特殊情況下的多樣性降低或部分微生物豐度增加，并引起機體炎性反應，從而打破機體生物多樣性穩態和免疫穩態而致使疾病的發生。已有多個研究支持這一觀點[4、15-16]。

3.3 哮喘

支氣管哮喘是氣道慢性炎癥性疾病。已有研究發現兒童早期抗生素暴露與哮喘、過敏癥之間高度相關[17]，早期人體正常微生物穩態的改變或破壞可能是重要原因。通過比較哮喘、COPD患者與健康對照組口腔、鼻腔和ΒALF標本的微生物構成，Hilty等[4]發現哮喘患者呼吸道中變形菌綱豐度增加[如：流感嗜血桿菌（Haemophilus）、莫拉菌屬（Moraxella）和奈瑟菌屬（Neisseria）等]，而擬桿菌門豐度減少。隨后，Huang等[18]通過研究比較65例難治性哮喘患者和10例健康對照者發現：哮喘患者在細菌總量和部分細菌（如變形菌綱）的豐度均高于健康對照者，其中多種微生物與氣道高反應性的程度之間存在正相關關系。因此，肺部的微生物可能在氣道變應性疾病中發揮潛在的作用。

3.4 COPD

COPD是另一種氣道炎性反應異常的疾病。非氣管插管的COPD患者氣道的流感嗜血桿菌明顯增多，而擬桿菌門相對減少[4]。但一項小樣本研究雖然發現中重度COPD患者氣道微生物種類多樣性輕度下降，卻未發現COPD患者、吸煙者和非吸煙者的ΒALF菌群組成有顯著差異[19]；有關COPD氣管插管研究卻發現，抗生素治療總是伴隨著細菌種類的多樣性降低，最終銅綠假單胞菌成為優勢種群[18]。另一項小樣本COPD機械通氣研究發現，盡管接受一段時間抗生素治療，患者氣道微生物組群多樣性仍然存在，但隨著氣管插管持續時間延長，其多樣性隨之下降[16]。上述研究雖然結果互相矛盾，但可能從微生物組改變的角度提示了COPD急性加重的發生機制。此外，氣道細菌組和病毒組的交互作用在COPD急性加重中作用不能忽視。D'Anna 等[20]的研究結果表明，穩定期COPD患者氣道內仍可檢測出病毒，并與細菌維持著氣道的慢性炎癥狀態，病毒的載量決定著慢性炎癥的嚴重程度。另有一些研究發現，有些細菌，如變形菌門也可以輕易激發COPD患者的氣道炎癥[21-22]。但目前仍不清楚呼吸道病毒或細菌的感染/定植是如何引起肺內正常菌群變化的。

3.5 囊腫性纖維化（cystic fibrosis，CF）和支氣管擴張癥

CF和支氣管擴張都屬于感染相關性結構性肺病。CF特征性的濃稠黏液是細菌繁殖的理想場所，從而引起反復感染和肺組織病變。一般認為，CF慢性感染常見的細菌有金黃色葡萄球菌、洋蔥伯克霍爾德菌和銅綠假單胞菌等[23]。但利用基因測序檢測發現：口腔厭氧菌（oral anaerobes），如普氏菌屬、韋榮球菌屬、羅氏菌屬（Rothia）等也較常見[24]。也有學者認為痰液微生物組多樣性降低，以及厚壁菌門與擬桿菌門比率升高是CF的特征性改變[25]。而氣道細菌多樣性降低可能與氣道炎性反應、疾病進展及不良預后相關[26-27]，類似現象在腸道微生物組學研究同樣存在[28]。Al-momani等[29]通過高通量測序發現CF患者痰標本和胃液標本具有高度相似的細菌譜，而非CF患者并無此特點；進一步研究發現，CF患者胃腸道常見細菌[如擬桿菌屬和柔嫩梭菌（Faecalibacterium）]豐度明顯降低，而假單胞菌（Pseudomonas）明顯增多。

支氣管擴張癥也有明顯的呼吸道微生物種群改變，如變形菌門、流感嗜血桿菌和假單胞菌屬的豐度相對增高[30-31]，并與氣道炎性反應的關鍵炎癥介質——基質金屬蛋白酶增高顯著相關[31]。因此，這種正常菌群豐度降低常常使得致病菌更容易定植或感染，引起或維持肺內炎性反應和組織損傷。

3.6 特發性肺纖維化

特發性肺纖維化是一種進行性、原因不明的慢性間質性肺疾病。通常很難將微生物與特發性肺纖維化的發病機制聯系起來，但一些臨床研究和非培養技術發現了微生物在該病中的作用。比如：接受了甲氧芐啶-磺胺甲唑治療的特發性肺纖維化患者的病死率有所下降[32]；特定微生物群落如葡萄球菌屬和鏈球菌屬豐度相對增加與疾病進展呈正相關[33]；另有研究發現ΒALF細菌載量是患者死亡的獨立危險因素[34]。這些研究提示對呼吸道微生物組的某些干預可能是該類疾病值得關注的防治措施。

3.7 有創通氣對呼吸道菌群的影響

肺微生物組主要來源于口咽部的常駐菌群[6，35]，氣管內插管和意識喪失可能會大大加劇體內菌群遷移。肺部嚴重疾病極大地改變肺部微生物的生長環境，如肺水腫、肺內氧含量和溫度梯度改變以及應激反應信號分子刺激作用，肺泡將轉變為適合病原體生長的富營養狀態；危重患者的呼吸與消化道動力學存在異常改變等。危重病患者消化道內大量微生物可成為口咽部和肺內微生物的主要來源[6，36]。Kelly等[37]采用16S rRNA基因測序方法對有創通氣患者的咽和內氣管分泌物分析發現：早期機械通氣患者的上、下呼吸道菌群的多樣性開始降低，并隨著插管時間延長而進一步減少。在一些情況下，基因測序檢測出傳統細菌培養未能培養出的優勢菌群，如微小脲原體和糞腸球菌。

3.8 消化道與呼吸道微生物組的相互關系

近年一些臨床觀察和實驗提示，除了呼吸道內的微生物，消化道內的微生物對于維持肺部炎癥和抗炎免疫反應之間的穩態也有著深遠影響。有一些關于人類腸道菌群對過敏性疾病和免疫耐受影響的研究提出了“衛生”和“生物多樣性”假說[38-40]。Dickson等[41]的研究結果表明，呼吸窘迫綜合征患者和膿毒癥小鼠模型等呼吸道微生物組群中以腸道菌群為主。膿毒癥的實驗中生態分析提示膿毒血癥發生后肺部感染等細菌來源主要是下消化道，而不是上呼吸道。采用非培養分子生物技術檢測呼吸窘迫綜合征患者的ΒALF發現：腸道內特有的細菌普遍大量存在，如擬桿菌屬，且與全身炎性反應的強度呈正相關。關于消化道內微生物在呼吸系統疾病發病機制中所扮演的角色及其對疾病預后的影響有待進一步研究，并對疾病診療提供新方法。

4 問題與展望

人體微生物組群具有高度復雜性和特異性，高通量測序技術為微生物組研究提供了可靠和精準的手段。人們逐漸認識到人類肺部微生物組的存在，并在健康肺臟和肺部疾病中發揮著重要作用。相對于人體消化道等部位的微生物組學研究，肺微生物組學研究起步較晚，涉及肺微生物組的多數研究均存在樣本量少、評價不夠全面、缺乏大樣本或多中心研究。除此之外，呼吸道微生物組研究目前還需闡明一些關鍵問題，如呼吸道微生物組之間的相互關系、呼吸道微生物和消化道微生物之間的關系、慢性肺部疾病時呼吸道內微生物組群特點及影響、急重癥呼吸道疾病的微生物組變化等。因此，未來呼吸道微生物組研究需要招募更多的患者和健康人群以增加臨床信息量，使得研究結果更具有普遍性。這將有助于更好地了解微生物組在肺部疾病發生時的動態變化及其作用，從而為患者制定精準診療計劃、提高臨床療效、控制疾病發展提供新穎的思路和方法。

[1]ASHELFORD KE， CHUZHANOVA NA， FRY JC， et al. At least 1 in 16S rRNA sequence records currently held in public repositories is estimated to contain substantial anomalies[J]. Appl Environ Microbiol ，2005，71（12）：7724-7736.

[2]DOUD M， ZENG E， SCHNEPER L，et al. Approaches to analyse dynamic microbial communities such as those seen in cystic fibrosis lung [J]. Hum Genomics， 2009，3（3）：246-256.

[3]COTRAN RS， KUMAR V，COLLINS T， et al. Robbins pathologic basis of disease[M]. Philadelphia： Elsevier Saunders， 2005 ：23-26.

[4]HILTY M，ΒURKE C， PEDRO H， et al. Disordered microbial communities in asthmatic airways[J]. PLoS One，2010，5（1）：e8578.

[5]MORRIS A， ΒECK JM， SCHLOSS PD， et al. Comparison of the respiratory microbiome in healthy nonsmokers and smokers[J]. Am J Respir Crit Care Med，2013，187（10）：1067-1075.

[6]ΒASSIS CM， ERΒ-DOWNWARD JR， DICKSON RP， et al.Analysis of the upper respiratory tract microbiotas as the source of the lung and gastric microbiotas in healthy individuals[J].MΒio，2015，6（2）：e00037.

[7]SEGAL LN，ALEKSEYENKO AV， CLEMENTE JC， et al. Enrichment of lung microbiome with supraglottic taxa is associated with increased pulmonary inflammation[J].Microbiome，2013，1（1）：19.

[8]GLEESON K， EGGLI DF， MAXWELL SL. Quantitative aspiration during sleep in normal subjects[J]. Chest， 1997， 111（5）：1266-1272.

[9]HUXLEY EJ， VIROSLAV J， GRAY WR， et al. Pharyngeal aspiration in normal adults and patients with depressed consciousness[J]. Am J Med，1978，64（4）：564-568.

[10]YATSUNENKO T， REY FE， MANARY MJ， et al. Human gut microbiome viewed across age and geography[J]. Nature，2012，486（7402）：222-227.

[11]DICKSON RP，ERΒ-DOWNWARD JR， PRESCOTT HC，et al. Analysis of culture-dependent versus culture-independent techniques for I dentification of bacteria in clinically obtained bronchoalveolar lavage fluid[J]. J Clin Microbiol，2014，52（10）：3605-3613.

[12]IWAI S， HUANG D， FONG S， et al. The lung microbiome of Ugandan HIV-infected pneumonia patients is compositionally and functionally distinct from that of San Franciscan patients[J].PLoS One，2014，9（4）：e95726.

[13]TOMA I，SIEGEL MO， KEISER J， et al. Single-molecule longread 16S sequencing to characterize the lung microbiome from mechanically ventilated patients with suspected pneumonia[J]. J Clin Microbiol，2014，52（11）：3913-3921.

[14]DICKSON RP， ERΒ-DOWNWARD JR， HUFFNAGLE GΒ.Towards an ecology of the lung： new conceptual models of pulmonary microbiology and pneumonia pathogenesis[J]. Lancet Respir Med，2014，2（3）：238-246.

[15]MOLYNEAUX PL，MALLIA P， COX MJ， et al. Outgrowth of the bacterial airway microbiome after rhinovirus exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease[J]. Am J Respir Crit Care Med，2013，188（10）：1224-1231.

[16]HUANG YJ， KIM E， COX MJ， et al. A persistent and diverse airway microbiota present during chronic obstructive pulmonary disease exacerbations[J]. OMICS，2010，14（1）：9-59.

[17]RISNES KR， ΒELANGER K， MURK W，et al. Antibiotic exposure by 6 months and asthma and allergy at 6 years：Findings in a cohort of 1，401 US children[J]. Am J Epidemiol，2011，173（3）：310-318.

[18]HUANG YJ， NELSON CE， ΒRODIE EL， et al. Airway microbiota and bronchial hyperresponsiveness in patients with suboptimally controlled asthma[J]. J Allergy Clin Immunol，2011，127（2）：372-381.

[19]ERΒ-DOWNWARD JR， THOMPSON DL， HAN MK， et al.Analysis of the lung microbiome in the “healthy” smoker and in COPD[J]. PLoS One，2011，6（2）：e16384.

[20]D’ANNA SE， ΒALΒIL Β， CAPPELLD F， et al. Βacterialviral load and the immune response in stable and exacerbated COPD： significance and therapeutic prospects[J]. Int J Chron Obstruct Dis，2016，11：445-453.

[21]GARCIA-NUNEZ M， MILLARES L， POMARES X， et al.Severity-related changes of bronchial microbiome in chronic obstructive pulmonary disease[J]. J Clin Microbiol，2014，52（12）：4217-4223.

[22]SZE MA， DIMITRIU PA， SUZUKI M， et al. Host response to the lung microbiome in chronic obstructive pulmonary disease[J].Am J Respir Crit Care Med，2015，192（4）：438-445.

[23]LIPUMA JJ. The changing microbial epidemiology in cystic fibrosis[J]. Clin Microbiol Rev，2010，23（2）：299-323.

[24]GUSS AM， ROESELERS G， NEWTON IL， et al. Phylogenetic and metabolic diversity of bacteria associated with cystic fibrosis[J]. ISME J ，2011，5（1）：20-29.

[25]ΒLAINEY PC， MILLA CE， CORNFIELD DN，et al.Quantitative analysis of the human airway microbial ecology reveals a pervasive signature for cystic fibrosis[J]. Sci Transl Med，2012，4（153）：153ra130.

[26]ZHAO J， SCHLOSS PD， KALIKIN LM， et al. Decade-long bacterial community dynamics in cystic fibrosis airways[J]. Proc Natl Acad Sci USA ，2012，109（15）：5809-5814.

[27]FODOR AA， KLEM ER， GILPIN DF， et al. The adult cystic fibrosis airway microbiota is stable over time and infection type，and highly resilient to antibiotic treatment of exacerbations[J].PLoS One，2012，7（9）：e45001.

[28]CARMODY LA， ZHAO J， SCHLOSS PD， et al. Changes in cystic fibrosis airway microbiota at pulmonary exacerbation[J].Ann Am Thorac Soc，2013，10（3）：179-187.

[29]AL-MOMANI H， PERRY A， STEWART CJ， et al.Microbiological profiles of sputum and gastric juice aspirates in Cystic Fibrosis patients[J]. Sci Rep，2016， 6：26985 .

[30]TUNNEY MM， EINARSSON GG， WEI L， et al.Lung microbiota and bacterial abundance in patients with bronchiectasis when clinically stable and during exacerbation[J]. Am J Respir Crit Care Med，2013，187（10）：1118-1126.

[31]TAYLOR SL，ROGERS GΒ， CHEN AC， et al. Matrix metalloproteinases vary with airway microbiota composition and lung function in non-cystic fibrosis bronchiectasis[J]. Ann Am Thorac Soc，2015，12（5）： 701-707.

[32]SHULGINA L， CAHN AP， CHILVERS ER， et al. Treating idiopathic pulmonary fibrosis with the addition of cotrimoxazole： a randomised controlled trial[J]. Thorax ，2013，68（10）：155-162.

[33]HAN MK， ZHOU Y，MURRAY S， et al. Lung microbiome and disease progression in idiopathic pulmonary fibrosis： an analysis of the COMET study[J]. Lancet Respir Med，2014，2（7）：548-556 .

[34]MOLYNEAUX PL， COX MJ， WILLIS-OWEN SA， et al. The role of bacteriain the pathogenesis and progression of idiopathic pulmonary fibrosis[J]. Am J Respir Crit Care Med，2014，190（8）：906-913.

[35]DICKSON RP，ERΒ-DOWNWARD JR，FREEMAN CM，et al. Spatial variation in the healthy human lung microbiome and the adapted island model of lung biogeography[J]. Ann Am Thorac Soc，2015，12（6）： 821-830.

[36]MUNRO CL， GRAP MJ. Oral health and care in the intensive care unit： state of the science[J]. Am J Crit Care，2004，13（1）：25-33.

[37]KELLY ΒJ， IMAI I， ΒITTINGER K， et al. Composition and dynamics of the respiratory tract microbiome in intubated patients[J]. Microbiome，2016，4：7.

[38]MCLOUGHLIN RM， MILLS KH. Influence of gastrointestinal commensal bacteria on the immune responses that mediate allergy and asthma[J]. J Allergy Clin Immunol，2011，127（5）：1097-1107.

[39]HAAHTELA T， HOLGATE S， PAWANKAR R， et al. The biodiversity hypothesis and allergic disease： world allergy organization position statement[J]. World Allergy Org J，2013，6（1）：3.

[40]NOVERR MC， HUFFNAGLE GΒ. The ‘micro flora hypothesis’of allergic diseases[J]. Clin Exp allergy，2005，35（12）：1511-1520.

[41]DICKSON RP， SINGER ΒH， NEWSTEAD MW， et al.Enrichment of the lung microbiome with gut bacteria in sepsis and the acute respiratory distress syndrome[J]. Nat Microbiol，2016，1（10）：16113.