固相萃?。毠軈^帶電泳法同時測定豆制品中4種堿性染料

張 偉，陳 艷，何豐瑞

（西安市疾病預防控制中心，西安710054）

堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22和堿性嫩黃O都屬于偶氮工業染料，主要用于腈綸、紡織品、紙張、皮革、家具等的染色［1］。這些染料具有致癌、致畸作用，對人體健康具有嚴重的危害?！吨腥A人民共和國食品添加劑使用衛生標準》及《中華人民共和國食品衛生法》規定，禁止堿性橙作為食品添加劑。由于這些染料在中性及偏堿性的條件下與蛋白質吸附牢固，不易褪色，而且成本低廉，一些不法食品生產商使用這些染料對豆制品進行染色，使之色澤光亮，欺騙消費者［2］。

目前，豆制品中這幾種堿性染料的測定方法有高效液相 色 譜 法［3－5］、液 相 色 譜－質 譜 法［6－7］、分 光 光度法［8］，我國食品中堿性染料的檢測標準使用直接提?。咝б合嗌V法，目前尚未見采用毛細管電泳法同時測定這幾種堿性染料的文獻報道。

毛細管電泳作為一種分離方法，具有綠色環保、儀器簡單、分析快速、分離效率高等優點，在實際樣品分析中應用越來越廣泛。本工作采用乙酸銨溶液提取、固相萃取的前處理方法，建立毛細管區帶電泳法同時測定堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22和堿性嫩黃O的分析方法，并應用于豆制品中堿性染料的測定。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

貝克曼P／ACE MDQ型毛細管電泳儀，配紫外檢測器；Turbo Vap型自動濃縮儀；未涂層熔融石英毛細管柱（75μm×40cm，有效長度30cm）；Oasis HLB固相萃取柱。

標準儲備溶液：1.000g·L－1，分別稱取10.00mg的堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、堿性嫩黃O，用水溶解后，定容至10mL，避光于4℃密封保存。使用時稀釋至所需質量濃度。

磷酸二氫鉀溶液：100mmol·L－1，稱取磷酸二氫鉀1.35g，用水溶解后，定容至100mL。

堿性橙2（純度 99.6%）、堿性橙 21（純度90.2%）、堿性橙22（純度95.4%）、堿性嫩黃 O（純度79.0%）標準品；甲醇、乙腈、氨水為色譜純；乙酸銨、磷酸二氫鉀為分析純；試驗用水為超純水（電阻率為18.2MΩ·cm）。

1.2 電泳條件

分離電壓20kV，分離溫度30℃，檢測波長210nm，進樣方式為壓力進樣（0.13MPa，0.5s），運行緩沖溶液為含20%（體積分數，下同）乙腈的40mmol·L－1磷酸二氫鉀溶液（pH 2.5）。每次進樣前按水、甲醇、水的順序清洗毛細管各1min，然后用運行緩沖溶液沖洗2min。

1.3 試驗方法

將樣品均質后，稱取樣品2.000g置于10mL具塞離心管中，加入50mmol·L－1乙酸銨溶液5.00mL，超聲提取30min，以3 000r·min－1轉速離心10min，將上清液取出置于離心管中，再加入50mmol·L－1乙酸銨溶液5.00mL提取一次，合并提取液后，以3 000r·min－1轉速離心10min后收集上清液。含油樣品加入正己烷2mL，渦旋振蕩萃取，棄去正己烷層，重復3次，待過柱濃縮凈化。

分別以甲醇3mL、水3mL活化HLB固相萃取小柱，將上述提取液5mL（用氨水調至近中性）加入萃取柱中，用3mL水淋洗后，加入氨水－乙腈（5＋95）混合液2mL洗脫，收集洗脫液。上樣和洗脫過程流量控制低于1mL·min－1。將洗脫液于30℃用氮氣吹至近干，加入乙腈－水（25＋75）溶液1.00mL，漩渦混勻30s后，過0.45μm 濾膜后待測。

2 結果與討論

2.1 檢測波長的選擇

將堿性橙2、堿性橙21、堿性22、堿性橙O的標準儲備溶液分別用水稀釋成50mg·L－1。以水為空白，分別在190～800nm內對各標準溶液進行紫外－可見吸收光譜掃描，這4種堿性染料在450，210nm處均有較強吸收。由于食品樣品基體復雜，在可見區域有較大干擾，并且由于儀器限制，不能在450nm處進行檢測，試驗選擇210nm作為檢測波長。

2.2 電泳條件的選擇

2.2.1 緩沖試劑和緩沖溶液的酸度

緩沖試劑的選擇主要由所需的酸度決定，而該酸度又因樣品的性質和分離效率不同而不同［8－9］。在毛細管區帶電泳中，待測物質在離子狀態下才能實現分離。這4種堿性染料均有氨基基團，在酸性條件下可解離，因此試驗選擇磷酸、磷酸二氫鉀作為分析的緩沖試劑。

緩沖溶液的酸度不僅能控制分析物的有效淌度，還控制著電滲流，同時對分析物的離子化程度有較大影響，因此是優化分離條件的重要因素。試驗考察了不同酸度（pH 2.5，3.5，4.5，5.5，6.5）的40mmol·L－1磷酸二氫鉀緩沖溶液對分離效果的影響，結果見圖1。

由圖1可知：隨著緩沖溶液pH減小，出峰時間、峰高和峰面積均增加。在試驗范圍內，pH越小，4種堿性染料的分離效果越好。因此，試驗選擇緩沖溶液的pH為2.5。

2.2.2 緩沖溶液濃度

緩沖溶液濃度通過影響溶液的黏度和電滲流，進而影響樣品的分離情況。一般情況下，緩沖溶液的濃度越高，電滲流越低，遷移時間就會延長，分離度增加。但是，緩沖溶液濃度的升高卻會增加焦耳熱，使峰形變寬，峰面積下降。試驗分別考察了使用20，40，60，80mmol·L－1磷酸二氫鉀溶液時，4種堿性染料的遷移時間和分離度。結果表明：隨著磷酸二氫鉀溶液濃度的升高，4種堿性染料分離度增加，但電流同時增加，遷移時間延長。綜合考慮，試驗選擇40mmol·L－1磷酸二氫鉀溶液。

2.2.3 添加劑的種類及其用量

運行緩沖溶液中添加有機溶劑，可以減少毛細管電泳的電滲流，降低焦耳熱，從而有利于物質的分離。有機添加劑通常具有較高的偶極矩和介電常數，并對被測物質有良好的溶解性。一般來說，甲醇、乙腈是比較合適的有機添加劑。試驗對比了不同有機溶劑（甲醇、乙醇、乙腈、丙酮）對4種堿性染料分離效果的影響。結果表明：添加甲醇、乙醇、丙酮使峰形拖尾，同時遷移時間也明顯增加；而添加乙腈能夠明顯改善峰形，增加分離度。試驗進一步比較了運行緩沖溶液中乙腈的體積分數對4種堿性橙分離效果的影響，結果見圖2。

結果表明：隨著乙腈體積分數的增加，峰形明顯改善，分離度增加，遷移時間減少。但過多的乙腈容易在毛細管內形成氣泡，造成基線波動，因此綜合考慮分離效果和基線波動等因素，試驗選擇添加20%的乙腈。

2.2.4 分離電壓和溫度

試驗比較了分離電壓在15～30kV時對4種堿性染料的分離效果的影響。結果表明：隨著分離電壓的升高，遷移時間縮短，但基線噪聲隨之增大。試驗選擇分離電壓為20kV。

圖1 運行緩沖溶液酸度對4種堿性染料分離效果的影響Fig.1 Effect of acidity of the running buffer solution on the separation efficiency of the four basic dyes

圖2 運行緩沖溶液中乙腈體積分數對4種堿性染料分離效果的影響Fig.2 Effect of the volume fraction of acetonitrile in the running buffer solution on the separation efficiency of the four basic dyes

圖3 4種堿性染料混合標準溶液的電泳圖Fig.3 Electrophorogram of mixed standard solution of the four basic dyes

毛細管的柱溫對遷移時間、電滲流重現性都有一定的影響［10］。試驗比較了分離溫度分別為20，25，30，35℃時4種堿性染料的分離效果。結果發現：在分離溫度為30℃時，4種堿性染料有較好的分離度并且遷移時間較短。

在最優條件下，混合標準溶液的電泳圖見圖3。

2.3 樣品前處理條件的選擇

2.3.1 提取液

文獻［10－14］中報道用于提取這4種堿性染料的溶液有乙酸－甲醇（1＋9）溶液、氨水－甲醇（1＋9）溶液、乙醇、乙醇（3＋7）溶液、乙酸銨溶液等。試驗在空白豆腐皮樣品中加入標準溶液，考察了以上提取液對4種堿性染料的提取效果。結果表明：50mmol·L－1乙酸銨溶液的提取率最高，同時便于下一步的濃縮凈化過程。因此，試驗選擇50mmol·L－1乙酸銨溶液作為提取液。

2.3.2 固相萃取柱

在堿性染料凈化的固相萃取柱的選擇上，HLB柱［15］、C18柱［7］、MCX 柱［16］均有文獻報道。試驗考察了這3種固相萃取柱的凈化效果，結果表明：MCX固相萃取柱與堿性橙的結合能力很強，必須使用二氯甲烷、三氯甲烷等溶劑才能洗脫，HLB固相萃取柱在雜質的去除和回收率上均優于C18固相萃取柱。因此，試驗選擇HLB作為固相萃取柱。

2.3.3 洗脫溶劑

試驗考察了不同類型洗脫劑（氨水－甲醇溶液、氨水－乙腈溶液、氨水－丙酮溶液）的洗脫效果，結果表明：氨水－甲醇溶液的洗脫能力差，不能夠將堿性嫩黃O完全洗脫下來；氨水－丙酮溶液洗脫能力太強，洗脫雜質多，不利于測定；氨水－乙腈溶液在保證將這4種堿性染料洗脫下來的前提下，洗脫的雜質少。試驗選擇氨水－乙腈溶液作為洗脫溶劑。

試驗進一步考察了氨水－乙腈溶液中氨水的體積數（0，1.0%，2.5%，5.0%，7.5%）對洗脫效果的影響，結果見圖4。

由圖4可知：隨著氨水體積分數的增加，堿性橙21、堿性橙22的回收率有明顯上升；當氨水體積分數為5%時，4種堿性染料的回收率達到最高。試驗選擇5%的氨水－乙腈溶液作為洗脫溶劑。

2.4 標準曲線、檢出限和測定下限

分別取標準儲備溶液適量，配制5個濃度水平的標準溶液系列，在優化的電泳條件下，由低濃度到高濃度分別進樣測定，從而得到4種堿性染料的線性回歸方程以及線性相關系數，見表1。線性回歸方程中y表示峰面積，x表示質量濃度。

將標準溶液按照不同的倍數稀釋加入樣品中，進行測定，分別根據3倍信噪比和10倍信噪比對應的樣品中待測物質含量，確定方法的檢出限（3S／N）和測定下限（10S／N），結果見表1。

圖4 氨水的體積分數對洗脫效果的影響Fig.4 Effect of volume fraction of ammonia on the elution efficiency

表1 線性參數、檢出限和測定下限Tab.1 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

2.5 精密度與回收試驗

取質量濃度為25mg·L－1的4種堿性染料的混合標準溶液，按試驗方法進行測定，在一天內連續測定6次，以峰面積的相對標準偏差（RSD）考察方法的日內精密度，連續6d進行測定，考察方法的日間精密度，結果見表2。

取空白豆腐干樣品，均質后稱取12份，其中3份測定本底值，其余分別加入3個不同水平的混合標準溶液進行加標回收試驗，每個水平測定3個平行樣品，并計算峰面積的RSD，結果見表3。

表3表明：本法的加標回收率為7 3.6%～93.1%，能夠滿足分析的要求。

表2 精密度試驗結果（n＝6）Tab.2 Results of test for precision（n＝6）

表3 回收試驗結果（n＝3）Tab.3 Results of test for recovery（n＝3）

2.6 樣品分析

應用本法測定腐竹和豆腐干等9種豆制品中的堿性染料，結果均未檢出。圖5為不同種類樣品及其加標（20mg·kg－1）后的電泳圖。

圖5 空白樣品與其加標后的電泳圖Fig.5 Electrophorograms of blank samples before and after spiking with standard solution

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