陽春砂種子休眠與萌發過程中同工酶活性變化的研究

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(廣州中醫藥大學中藥學院， 廣東 廣州 510006)

陽春砂(AmomumvillosumLour.)為姜科豆蔻屬植物，其干燥成熟果實作砂仁藥用[1]。砂仁具有化濕開胃、溫脾止瀉、理氣安胎的功效[1]，為中醫治療腸胃疾病的常用藥材，主要產于廣東、廣西、云南、福建、海南等省區，是我國著名的四大南藥之一。春砂仁種皮堅硬，具種皮障礙休眠和輕度胚休眠的特性，種子出芽慢且出芽不整齊。近年來，眾多學者多側重于研究篩選快速打破陽春砂種子休眠、促進種子萌發的方法[2-5]，而有關陽春砂種子休眠與萌發過程中的生理特性研究卻鮮見報道。種子的休眠與萌發是一個相互影響和制約的生理代謝過程，是在遺傳、物質代謝、激素平衡、信號傳導、二次休眠等因素的共同作用下完成的[6]，種子萌發發育時所需的營養物質和能量主要來源于蛋白質、淀粉、脂肪等主要貯藏物質，這些貯藏物質在提供營養的同時，蛋白質酶、淀粉酶、脂肪酶及其他相關的物質代謝酶也在相應地發生變化。種子萌發是通過種子內幾乎所有酶系統活性增加和新酶系統的出現為征兆的[7]。

同工酶技術廣泛應用于植物、動物、微生物、農業及醫學等領域的物種遺傳變異、鑒定及生長發育過程等方面[8]。近年來，也應用于種子休眠與萌發研究中，并發現過氧化物酶(POD)、酯酶(EST)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)等與其有關。目前有關陽春砂種子休眠和萌發過程同工酶的研究尚無相關報道。本試驗針對陽春砂種子具有休眠特性、萌發困難等特點, 開展其休眠和萌發過程中同工酶(過氧化物酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和酯酶)活性及同工酶譜的研究, 探討種子萌發過程中同工酶活性的變化，為陽春砂種子休眠與萌發過程生理調控機制的探討提供科學依據。

1 材料、儀器與試劑

1.1 材 料

分別于2013年和2014年，采摘春砂仁道地產區完全成熟的新鮮果實，剝棄果皮，剝開種子團，去除假種皮與雜質，置陰涼通風處，攤晾至干，裝于密封袋內置4 ℃貯存，備用。

1.2 儀器與試劑

高速低溫冷凍離心機(北京普析通用儀器有限責任公司)；移液槍(國產DRAGON)；Mini-垂直型電泳儀(美國Bio-Rad公司)；POD活性測定試劑盒(南京建材有限公司)；SOD活性測定試劑盒(南京建材有限公司)；丙烯酰胺-甲叉丙烯酰胺(Arc-Bis)、 過硫酸銨(AP)、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸，均購自美國Bio-Rad公司；其余均為國產分析純。

2 方 法

2.1 種子的引發處理及發芽試驗

取陽春砂種子適量，置燒杯中，用適量濃H2SO4浸泡3 min后，傾去濃H2SO4，用蒸餾水沖洗至pH呈中性，將種子置紗網上揉搓至有香氣后，用400 mg/L的赤霉素溶液低溫浸種72 h，傾去赤霉素溶液，用蒸餾水沖洗3次，然后將種子置于以紗布作芽床的培養皿中，于25～28 ℃光照條件下培養，分別于浸種前、浸種后、培養10 d、種子露白(培養大約30 d)、胚芽長至1 cm時(培養大約40 d)取樣，用密封袋保存，置-80 ℃貯存，備用。

2.2 陽春砂種子POD、SOD同工酶活性的測定

分別取-80 ℃下的各樣品適量，液氮研磨至粉末，參照試劑盒的方法測定各樣品的POD及SOD同工酶的活性，記錄并繪制曲線圖。

2.3 酶液的制備

分別稱取-80 ℃下的各樣品1 g，經液氮研磨至粉末，按1∶2的比例加入0.1 mol/L的磷酸緩沖液(pH=7.5)2 mL冰浴研磨成漿，轉移至離心管，4 ℃下、10 000 r/min離心15 min,吸取上清液，-20 ℃貯存備用。超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT) 同工酶提取時需用0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH=7.5,含5 mmol/L DTT和5% PVP)。

2.4 陽春砂種子POD、SOD、CAT及EST同工酶電泳

對提取到的酶液進行Native-PAGE電泳，濃縮膠采用4%、分離膠采用7.5%，點樣量為20μL/樣孔。濃縮膠采用80 V電壓，待樣品在濃縮膠壓成直線進入分離膠后，120 V電泳，直至溴酚藍指示帶距離底部1～1.5 cm處停止。再采用聯苯胺染色法、NBT染色法、鐵氰化鉀染色法和堅牢藍染色法分別對POD、SOD、CAT及EST同工酶染色至條帶清晰，并拍照記錄。

3 結果與分析

3.1 陽春砂種子休眠與萌發過程POD、SOD同工酶活性變化趨勢

結果見圖1和圖2。從圖中可看出,陽春砂種子浸種后POD同工酶酶活性急速下降，隨后在種子萌動至露白前呈緩慢上升趨勢，而在露白至長出胚芽期間活性又急劇上升。陽春砂種子在休眠與萌發過程中SOD酶的活性變化則是：種子經激素浸種處理后酶活性有所下降，后整體略呈直線上升的趨勢。

圖3 陽春砂種子休眠與萌發過程中POD同工酶圖譜

注：1為浸種前；2為浸種后；3為培養10 d；4為露白；5為胚芽1 cm。下同。圖1 陽春砂種子休眠與萌發過程中POD同工酶活性變化

圖2 陽春砂種子休眠與萌發過程中SOD同工酶活性變化

3.2 陽春砂種子休眠與萌發過程同工酶譜帶研究

3.2.1 POD同工酶譜

陽春砂種子休眠與萌發過程的POD同工酶出現譜帶可劃分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4個區帶(見圖3)，其中干種子的POD同工酶譜帶共有5條，均分布于Ⅱ區；浸種后及培養10 d種子的POD同工酶譜均在Ⅲ和Ⅳ區各新增1條條帶，Ⅱ區則均減為1條，且顏色較淺，顯示其活性較弱；種子露白及胚芽長1 cm時，Ⅲ和Ⅳ區的條帶數保持不變，后者在Ⅰ區新增了1條新的條帶，而二者在Ⅱ區的條帶數則遞增，顏色呈逐漸加深的趨勢，顯示其活性增強，表明陽春砂種子休眠與萌發過程中POD同工酶活性呈先減弱后不斷增強的趨勢，期間POD同工酶的種類也發生了相應的變化。

3.2.2 SOD同工酶譜

如圖4所示，陽春砂種子浸種前后SOD同工酶的譜帶均較亮，浸種后較浸種前減弱，說明浸種后種子代謝活動有所減弱，而培養10 d后種子至種子露白到長出胚芽期間，SOD同工酶譜帶亮度又有所增強，表明其活性呈先減弱后不斷增強的趨勢，這與SOD活性測定結果一致。

3.2.3 CAT同工酶譜

如圖5所示，浸種前后及培養10 d的陽春砂種子的CAT同工酶譜帶均只有1條，且顏色深淺變化不明顯。露白及長出胚芽時種子CAT同工酶譜帶均變為2條，且條帶顏色不斷加深，由此表明，陽春砂種子中CAT同工酶在萌發前期相對穩定，到露白期活性開始增強，酶種類也在增加。

3.2.4 EST同工酶譜

如圖6所示，陽春砂種子休眠與萌發過程中EST同工酶一共出現4條條帶，浸種后種子的EST同工酶譜帶數較干種子減少1條，且條帶色澤減弱，表明浸種后的陽春砂種子EST同工酶的活性減弱，培養10 d及露白的種子EST同工酶合成增加，并出現新酶帶Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，且同工酶活力在種子露白期達到高峰，而長出胚芽的種子條帶數又減至2條。由此表明，陽春砂休眠與萌發過程的EST同工酶的活性呈先減弱后增強再減弱的變化趨勢，種子露白時活性達到最強。

4 討 論

研究篩選了陽春砂種子POD、SOD、CAT及EST同工酶聚丙烯酰胺凝膠電泳條件：同工酶酶液提取方法篩選結果顯示，提取液體積比1∶2時最佳，不同提取液對POD及EST同工酶的提取效果無顯著差異，SOD及CAT同工酶需用0.1 mol/L的磷酸緩沖液(pH=7.5,含5 mmol/L DTT和5% PVP)防止氧化進行提取。單向垂直電泳條件的篩選結果顯示，膠濃度、點樣量及電壓均對最后的結果影響不大。因此，陽春砂種子同工酶電泳的關鍵在于酶液的制備，確保提取過程中酶的活性對后續的實驗至關重要。

圖4 陽春砂種子休眠與萌發過程中SOD同工酶圖譜

圖5 陽春砂種子休眠與萌發過程中CAT同工酶圖譜

圖6 陽春砂種子休眠與萌發過程中EST同工酶圖譜

POD同工酶與植物體內多種代謝活動有關，參與細胞分化和一些生理活性物質的合成與降解，在植物抗逆境脅迫中，與SOD、CAT一樣都是非常關鍵的酶，能夠消除氧自由基對細胞的損傷；EST也參與植物體生長發育過程中的多種生理過程[9-13]。研究結果顯示，陽春砂種子從開始培養到長出胚芽階段，POD、SOD、CAT同工酶活性基本呈上升趨勢，并且在露白到長出胚芽階段急速上升，說明種子開始萌發時，整個生理代謝活躍起來，尤其是種子開始露白，也即真正萌發的階段，在萌發中后期，酶活性急劇增加也在一定程度上說明了種子在萌發時糖類和脂類的代謝產生了大量的有害產物(如脂質過氧化物)，會對細胞、生物體造成傷害，因此，這些有害產物就會誘導防御系統相關酶(POD、SOD、CAT)的合成增加，來清除有害產物，從而促進種子的萌發；同時Roberts等也曾指出，POD酶活性的增加導致HMP途徑的加速，可能是萌發的重要原因[14]，與本實驗的結果一致；另一方面，種子由干燥休眠狀態到吸脹狀態，POD、SOD活性減小，表達量很低或幾乎沒有表達，說明干種子細胞膜受到活性氧自由基的影響較大，種子浸種后代謝減弱，營養物質被貯藏不被代謝，為萌發作準備，因此所產生的有害產物較少。EST同工酶浸種后a、b條帶顏色均變淺，后又開始加深，并且在露白時期出現了新的條帶，說明種子在浸種時代謝減弱，而萌發后代謝活躍，條帶顏色加深并出現新的條帶,與POD、SOD及CAT同工酶結果一致。陽春砂種子休眠與萌發過程中POD、SOD、CAT、EST同工酶條帶的變化，在一定程度上表明了這些同工酶基因的表達導致了陽春砂種子休眠的打破和最終的萌發。

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