植物種子發育相關NAC家族轉錄因子研究進展

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(貴州師范大學蕎麥產業技術研究中心， 貴陽 550001)

1 植物種子發育過程研究

高等植物種子的發育開始于胚珠里發生的雙受精過程，結束于形成下一代繁殖所需的成熟的休眠種子。從形態學來說，種子發育過程經歷3個標志性的時期，即細胞分化、器官形成和種子成熟[1]。以模式植物擬南芥為例(圖1)[2]，從花受精到種子成熟一共持續19 d，期間種胚發育過程從原胚期開始(0 d)，經過球形胚前期(1 d)、球形胚期(3～4 d)、心形胚期(5～6 d)、魚雷形胚期(7～8 d)、綠熟期(13～14 d)，到種子后熟期(18～19 d)，然后種子進入休眠狀態，等待下一代萌發。胚乳發育包括游離核期、細胞化期和吸收期。胚柄和胚體的分化發生在受精后1～5 d，細胞和組織的分化發生在受精后4～6 d，頂端/根分生組織的分化在受精后第5天，子葉和軸的發育在受精后6～18 d，營養儲存物質的積累從受精后第7天開始，一直到種子后熟(第19天)。種子后熟時種子大量失水，隨后進入休眠期。從細胞角度而言，受精后前8 d主要是細胞分化時期，9～19 d主要是細胞擴張時期。

種子的發育和營養物質積累過程依賴于大量基因的表達和調控，研究這些基因的表達調控規律有助于了解種子發育過程中各種營養物質積累的分子機制。擬南芥[2]、水稻[3]、小麥[4]、大豆[5]、油菜[6]、大麥[7]等種子發育過程的轉錄組學分析挖掘了大量與之相關的調控和功能基因。轉錄因子是參與植物表達調控的重要反式作用因子,它們在種子發育和籽粒灌漿的過程中具有重要調控作用[1]。玉米種子發育過程中共檢測到414個轉錄因子的表達，其中113個轉錄因子在發育的胚乳中優勢表達，它們主要為bZIP(13%)、鋅指蛋白(17%)和NAC(11%)幾個家族成員[8]。對玉米發育不同時期和組織的基因表達情況進行分析，篩選出218個在種子中上調表達的轉錄因子，它們分屬于43個不同的轉錄因子家族，包括MYB、AP 2、B 3、NAC等[9]。大豆種子發育過程中的轉錄組學分析表明，19個轉錄因子在脫水和干旱的種子中的表達量高于幼嫩時期的種子[5]。穎片是離種子最近的營養器官，19個WRKY和16個NAC轉錄因子在大麥種子灌漿期上調表達，表明這些轉錄因子可能參與調控能量從穎片向種子的轉運[7]。油菜灌漿期種子和角果皮的轉錄組分析表明，HB、Aux/IAA、bHLH、C 2 C 2-CO-like、MYB和REM幾類轉錄因子在灌漿期的種子和角果皮中大量表達[10]。

2 植物NAC轉錄因子研究

NAC是一類植物特有的轉錄因子家族，研究表明，其廣泛參與到植物生長發育過程及各項生理活動，如胚和頂端分生組織的發育、次生根的形成、激素信號的響應、防御和抗逆、衰老等[11]。最初的NAC轉錄因子作為干旱響應因子被鑒定，從失水脅迫的擬南芥中克隆了9個基因，分別為RD19(RESPONSIVETODEHYDRATION26)、RD21、RD22、RD29、RD17、RD20、RD28、RD26，其中RD22和RD29的表達也可以被生長素脫落酸所誘導；通過對RD 28編碼蛋白序列的分析，表明該蛋白是跨膜通道蛋白大家族中的一員[11-12]。隨后越來越多的NAC家族轉錄因子被鑒定出來，包括矮牽牛的NAM和擬南芥ATAF 1/2和CUC 2 三個蛋白，NAC家族轉錄因子的命名也是由三個蛋白的首字母組成[12]。隨著植物基因組學的發展，NAC轉錄因子在全基因組水平上的鑒定和分析在多個植物物種中完成，到目前為止，擬南芥中鑒定到117條，水稻中鑒定到151條[13]，大白菜中鑒定到204條[14]，木薯中鑒定到96條[15]，桑樹中鑒定到79條[16]，西瓜中鑒定到82條[17]，玉米中鑒定到128條[18]，土豆中鑒定到110條[19]，蘋果中鑒定到256條[20]，葡萄中鑒定到71條[21]，還有一些其他物種[22-23]，這些物種中的NAC家族轉錄因子得到了廣泛的鑒定和系統的分析，包括其結構、保守模體、進化關系、表達模式等。Nakashima等[12]對擬南芥、水稻、石松和苔蘚4個物種中的大多數NAC基因進行了的系統發育分析，根據保守氨基酸和NA結構域的分析，4個物種中的NAC基因被廣泛地分為六大類(圖2 A)。同一大類中的NAC基因功能相近，如許多脅迫響應的NAC基因都歸屬于SNAC(Sress-responsive NAC)大類。NAC家族參與脅迫響應報道最為多見，SNAC大類基因又被細分為SNAC-A，SNAC-B，和SNAC-C三類(圖2 B)，其中擬南芥和水稻的SNAC基因集中在SNAC-A和SNAC-B兩類中，石松和苔蘚的SNAC基因集中在SNAC-C類中。以上研究表明，六大類NAC轉錄因子在很早的時期就已經存在(至少在古老的低等植物苔蘚中)，同時，SNAC-A和SNAC-B兩類NAC轉錄因子的分化發生在石松類植物和其他維管植物的分化之后，但是在單子葉和雙子葉植物的分化之前。

圖1 擬南芥種子發育示意圖(圖片引自Le等，2010)

NAC家族蛋白的氮端含有一個高度同源的區域，即與DNA結合的NAC結構域，該結構域長約150個氨基酸，含有5個保守區域(A-E)。利用X射線晶體學研究了擬南芥ANAC 019蛋白NAC結構域的結構，發現NAC結構域缺少經典的螺旋-轉角-螺旋模體，多了一個新的由一些螺旋狀元素包裹一個扭曲的β片層組成的TF折疊模體；同時，2個NAC結構域可以形成一個有功能的二聚體結構[11]。水稻中一個響應脅迫的NAC蛋白(SNAC 1)的結構也被鑒定了出來，SNAC 1的NAC結構域的結構與擬南芥ANAC 019的結構相似，并且也是形成二聚體起作用[24]。此外，氮端的NAM結構域還含有一個核定位信號，NAC家族蛋白碳端區域是高度變異的，含有轉錄激活域，有些NAC蛋白碳端區域含有蛋白結合活性的模體，而另一些NAC蛋白碳端區域含有跨膜模體[11]。

注：A為NAC家族蛋白的系統發育關系示意圖；B為SNAC亞家族的系統發育樹。圖2 擬南芥、水稻、石松和苔蘚四種植物中NAC結構域的系統發育樹。(圖片引自Nakashima 等，2012)

3 NAC轉錄因子調控種子發育過程

通過基因表達分析，發現NAC轉錄因子參與調控植物花發育、響應激素信號、響應生物和非生物脅迫信號、響應光信號、細胞程序化死亡和衰老等[11]。植物NAC轉錄因子調控種子發育和籽粒灌漿過程在以小麥和水稻為代表的多種植物中可見報道。小麥NAM家族中多個基因影響種子谷粒蛋白含量，從野生二粒小麥Gpc-B 1數量性狀位點克隆到一個NAC家族轉錄因子TtNAM-B 1，通過RNA 干擾技術沉默TtNAM-B1及其同源基因TtNAM-A1和TtNAM-B2后，與對照相比,干擾株系延緩衰老3周，并且種子蛋白、鐵、鋅含量減少了30%左右，表明NAM基因參與調節小麥衰老，有利于提高種子蛋白、鐵、鋅含量；隨后普通小麥中NAM同源基因也被驗證具有相似作用[25]。分別在16個小麥及小麥近源種中克隆出NAM-B1基因，對其序列進行分析,發現NAM-B1基因SNP位點變異與谷粒蛋白含量存在一定的相關性：在一個NAM-B1堿基突變提前形成終止密碼子,產生無義氨基酸的材料中，谷粒蛋白含量最低[26]。對TtNAM-B1基因的過表達和干擾株系進行轉錄組學分析，篩選到619個受該基因調控的下游基因，其中包括轉運蛋白、激素調節基因、轉錄因子等[4]。最近，TtNAM-B1的同源基因NAM-G1也被發現具有相似的功能，可以增加谷粒蛋白含量；另一個同源基因TaNAC-S在小麥中過表達后使谷粒中N含量增加[27]。NAM基因在中國春小麥的不同組織中均有表達，其中TaNAM-D1在籽粒中的表達豐度最高[28]。

水稻種子中NAC轉錄因子影響水稻的抗逆性、谷粒灌漿及產量[29-30]。OsNAC5基因在灌漿期的水稻旗葉中上調表達，參與了營養物質從綠色葉片到種子的轉運。OSNAC9和OsNAC10兩個基因可以改變水稻的根系結構，增強抗旱性，進而提高產量。ONAC023基因在受粉后3 d和7 d的水稻種子中特異表達，以其為誘餌通過酵母雙雜交技術，調取到21個與之結合的蛋白，其中有2個谷蛋白編碼基因。

其它物種中，NAC家族轉錄因子與種子發育的關系也有報道。通過轉錄組學分析鑒定在玉米胚乳中表達的NAC家族轉錄因子，其中APN-1在授粉后5 d的種子中大量表達，并在授粉后20 d的種子中達到最大值；對其上游啟動子序列進行分析，發現其中含有胚乳特異、ABA和GA響應的順式作用元件；將APN-1上游啟動子序列連接GUS基因進行瞬時表達，發現該基因只在胚乳的糊粉層中表達，表明其可能調控胚乳的發育[8]。從大豆中克隆了6個NAC轉錄因子，均由3個外顯子和2個內含子組成，均含有保守的NAM結構域；對其表達模式進行分析，表明6個NAC基因先隨著種子發育表達量逐漸增加，在30～35 d的大豆種子中最高，隨后逐漸降低；組織特異性分析表明，GmNAC2 和GmNAC5兩個基因在灌漿期的種子中表達豐度最高[31]。

4 結論和展望

種子發育是植物重要的生長過程之一，植物特有的NAC家族轉錄因子在這一過程中起重要調控作用。小麥NAM家族基因的表達參與谷粒蛋白含量、植株衰老、鐵、鋅和氮含量的調控；水稻NAC轉錄因子調控水稻的抗逆性、谷粒灌漿，最終影響產量；玉米、大豆等其他物種中NAC家族轉錄因子在種子中存在組織特異性表達。與NAC家族轉錄因子參與植物抗逆性相比，其調控種子發育的研究相對較少，通過反向遺傳學、基因組學和蛋白質組學等方式鑒定更多與種子發育相關的NAC轉錄因子十分迫切。同時，由于一些NAC轉錄因子可能在植物的生長發育過程中有多種作用，往往不僅僅只調控一個單一的生長發育過程，也存在著多個NAC轉錄因子調控同一生長發育過程的情況，因此研究一個NAC轉錄因子調控多個生長發育過程或多個NAC轉錄因子調控同一生長發育過程的調控網絡十分必要。

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