痰液檢驗對肺曲霉菌病的診斷價值探討

蘇永華 李賽玉 陳麗靜 李彩香 鐘素成

近幾年來，臨床肺曲霉菌病發病率逐年攀升，死亡率高，但實驗室檢查診斷準確性較低，疾病診斷準確性也更低[1]。肺曲霉菌病判定金標準為組織病理判定，但危重疾病者取得病變組織難度較大，雖給予影像學診斷，可得到部分典型性影像特征，但會延遲診斷時間，缺乏特異性。實驗室高靈敏度曲霉菌PCR檢查，測定血液內曲霉菌細胞壁成分半乳甘露聚糖的GM實驗均在臨床得到快速應用，但仍然無法代替培養病原維生物的痰液標本標準化檢驗，識別痰液檢查有形成分，培養污染得到控制，為及時、準確的判定肺曲霉菌病提供一定實驗依據，降低疾病死亡率[2]。本研究納入280例痰液標本，意在分析痰液檢驗診斷肺曲霉菌病的臨床價值。具體報告如下。

1 資料及方法

1.1 一般資料

隨機抽取280例實驗室痰液培養標本，包含男性152例，女性128例，年齡（63.2±1.2）歲，120例存在肺炎、COPD、支氣管擴張、肺結核等肺部基礎性疾病，124例器官惡性腫瘤，36例其他疾病。分布在我院ICU住院病例、腫瘤科、小兒科、神經外科、消化血液內科、呼吸內科等。

1.2 方法

1.2.1 檢驗痰液的方法 檢驗痰液包含孢子檢查、真菌菌絲檢查、細胞成分檢查、真菌培養等。

1.2.2 留取痰液標本 采集標本的方法包含吸痰器抽、纖維支氣管鏡輔助抽吸、自主咳痰。按照其病情狀況和意識狀況給予合理性留取方法。護理人員需仔細向患者講解留取標本注意事項，咳痰前需用生理鹽水漱口3次，再咳嗽，并輔助性叩擊其背部，將肺部深處痰液咳嗽出，所咳出的第一口痰液需丟棄，第2～5口痰液留取10 g，吐入到無菌培養皿直徑9 cm中，1 h內送檢。若延遲送檢，需將其放入到6℃左右環境中保存，2 h內送檢。持續送檢3 d。針對痰液黏稠，且不易咳出者，可用蒸餾水進行霧化后，再將其吸出，并給予輔助方式將痰液標本抽取。

1.2.3 痰液培養 把所接收的標本進行沙氏培養基、中國藍培養基、羊血培養基。接種量為0.5～1 g。3 mm直徑接種環取5次，不同痰液黏稠度進行加減。并放置在37℃培養箱中培養24～72 h。并實施藥敏試驗與真菌菌種鑒定。

1.2.4 痰液顯微鏡檢查 取5 g痰液，將其均勻涂抹在無菌載玻片上，涂抹范圍為2 cm×4 cm，厚薄合適則可。低倍鏡觀察第1片痰液成分，順著軌跡，從左到右瀏覽全片，并觀察上皮細胞與孢子、真菌菌絲體、顆粒狀物、螺旋體、白細胞、吞噬細胞、柱狀上皮細胞、鱗狀上皮細胞的關系。加入10% KOH溶液3滴到第2片上，加蓋玻片，用低倍鏡查找菌絲體與真菌孢子。瑞士染色處理第3片，準確分類各細胞。

1.2.5 判定痰液標本的合格性 按照痰液所含成分、形狀和顏色綜合判定痰液質量，顯微鏡低倍視野：白細胞指標＞25個、鱗狀上皮細胞＜10個或白細胞/上皮細胞＞2.5個；唾液樣需直接判定為不合格性標本，需重新留取包含食物殘渣的標本。需檢驗并符合以下任何一項指標：（1）WBC指標高，膿性各色痰液；（2）暗紅色、鮮紅血性痰液；（3）漿液性或黏液性，白細胞指標＞25個、鱗狀上皮細胞＜10個或白細胞/上皮細胞＞2.5個；（4）顯微鏡下存在大量細或粗顆粒狀物，少見粒細胞成分。

1.3 指標判定

培養可疑：持續3天送檢，各合格痰液內任意一種，2次或2次以上痰培養均屬于同一菌株和三種培養基均可生長。生長陽性：持續三天送檢，排除第三類合格痰液中任意一種，查見真菌孢子次數為3次，痰培養≥2次為三種培養基和同一菌株均可生長：（1）查見螺旋體次數≥1次；（2）嗜酸性粒細胞≥50%；（3）柱狀上皮細胞≥2+/HP。協同陽性：持續3天送檢，4類合格痰液中任意一種≥2次痰培養：（1）查見菌絲次數≥1次；（2）嗜酸性粒細胞≥10%。

1.4 統計學方法

研究計量和計數數據均用統計學軟件（SPSS 13.0版本）分析，表示方式、（n，%），計數資料比較采用χ2檢驗，若P＜0.05，則判定結果存在統計學意義。

2 結果

2.1 痰液真菌培養種類分布

280例痰液標本中，陽性占比最高為念珠菌63.93%，其次為煙曲霉菌26.79%。見表1。

2.2 顯微鏡下其他真菌與曲霉菌的區別

曲霉菌菌絲分支分隔為銳角，無色素，2～4 μm寬度，孢子形狀為圓形，且小。念珠菌菌絲為1～2μm寬，屬于假菌絲，孢子形狀為圓形，往往有出芽。毛霉菌菌絲體積較寬，分支為直角，2～8μm寬度。經臨床診斷后共21例培養可疑，29例生長陽性，34例協同陽性。培養可疑、生長陽性、協同陽性三者兩兩比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。經檢查后過敏性肺曲霉肺炎共6例，34例侵襲性肺曲霉菌病，45例肺曲菌球，給予痰液培養檢查，對比肺曲菌球陽性率（17.78%）與侵襲性肺曲霉菌?。?9.41%）、過敏性肺曲霉肺炎陽性率（83.33%），差異有統計學意義（P均＜0.05）。見表3。

表1 痰液真菌培養種類分布[n（%）]

表2 各痰液培養標準對判定肺曲霉菌病的有效率

表3 不同肺曲霉菌病痰液培養陽性率[n（%）]

3 討論

曲霉菌也稱弗狀菌，此為需住院接受治療的系統性真菌。多在腎移植患者中發病，患者死亡率可達70%以上[3]。引發疾病的曲霉菌類包含黑曲菌、上曲菌、黃曲菌、煙曲菌等。肺組織為感染曲霉菌的一個好發器官。人類95%的曲菌病菌因煙曲菌而引發的[4]。本次研究表明，曲霉菌為痰液真菌培養陽性率第二位。

感染肺曲霉菌機理不同，痰液檢出率不同：臨床將肺曲霉菌分三個類型：侵襲性肺曲霉菌病、過敏性支氣管肺曲霉菌病、慢性肺曲霉菌病。侵襲性肺曲霉菌多在各種器官移植、以及各種惡性腫瘤、HIV病毒感染、白血病等患者中發生。嚴重破壞肺組織，引發廣泛性化膿性肺炎，合并形成膿腫，容易引發凝固性急性壞死，快速擴展，治療難度大，其死亡率高。因病變位置排出膿性分泌物，給予痰液培養檢出曲霉菌的可能性較大[5]，本研究中侵襲性肺曲霉菌病的培養陽性率達79.41%，與文獻相符[6]。而在判定過程中隨著判定標準的提升，特異性也有所增高，本研究中表2則明確體現了此點。慢性肺曲霉菌病包括：曲霉球、曲霉結節、慢性壞死性肺曲霉病、慢性空洞性肺曲霉菌病及慢性纖維化性肺曲霉菌病，其中肺曲霉球繼發在肺結核空洞、肺膿腫、支氣管擴張、支氣管囊腫，繁殖于肺部空腔中，曲霉菌早期可因痰液排出人體外，形成晚期曲霉球，和支氣管幾乎不相通，給予痰液培養，檢出曲霉菌的可能性亦明顯降低。

建立痰液曲霉菌檢驗標準[7]：自然界中均廣泛存在曲霉菌，曲霉孢子體積小，數量多，且在空氣中的懸浮可能性較大，食物內污染可能性較大。且給予真菌培養痰液標本和顯微鏡檢查痰液標本，具有隨意性，導致真菌培養痰液存在容易污染到標本、標本取樣不夠規范性的問題，進而降低了曲霉菌陽性率。

解決以上問題的思路為留取痰液標本，并保存、檢查、培養等過程，確保痰液標本合格，以免被曲霉菌孢子污染，采用足夠量標本。采集標本前需漱口，并丟棄第一口痰液，降低痰液留取中污染性，痰液內多種培養基培養、多次連續培養、菌絲體為鑒別偶爾污染的指標。曲霉菌菌絲體僅在曲霉菌病灶位置繁殖可發生，散布在空氣內孢子污染則不會發生菌絲體，給予顯微鏡觀察可見較大菌絲體[8]。曲霉菌多次培養可將污染因素成功篩選出。痰液細胞、性狀、顏色，以及有形成分均有利于判定痰液的病理意義，或是否合格。扁平磷狀上皮多在咽部、口腔部位分布，纖毛柱狀上皮則主要分布在各段支氣管和主支氣管部位。螺旋體多存在小支氣管部位，呈凝固蛋白絲。嗜酸性粒細胞和中性粒細胞雖不屬于肺部成分，但肺部過敏性病變痰液嗜酸性細胞會顯著增多，如合并曲霉菌，表明存在肺曲霉菌病變應性支氣管炎。肺部曲霉菌和細菌感染往往合并產生，當給予抗生素治療，可降低痰液膿細胞，痰液往往存在壞死顆粒物質中。痰液定量顯微鏡涂片檢查與培養，可提升曲霉菌檢出可能性，避免發生漏檢，尤其是給予KOH飽和液涂片檢查，痰液內細胞成分被破壞掉，提升微小孢子和曲霉菌絲體檢出率。

診斷肺曲霉菌疾病，按照是否合并基礎性疾病，并結合實驗室指標和影像學狀況實施分級、綜合診斷。但各檢查方式均具有一定限制性。將組織病理檢查和無菌位置曲霉菌培養作為金標準。但危重患者，不易得到活檢標本，培養血液標本的陽性率較低。綜上，痰液檢驗在診斷肺曲霉菌病中作用明顯，可早期準確判定肺曲霉菌病，以便及時給予有效診治，降低疾病死亡率，值得推廣。