銀杏二萜內酯K抗血小板聚集及神經保護作用研究

陶曉倩+曹澤彧+曹亮+蕭偉

[摘要] 觀察不同濃度的銀杏二萜內酯K（GK）對血小板活化因子（PAF）誘導血小板聚集的拮抗作用及對缺血再灌注損傷細胞和動物模型的神經保護作用。制備GK家兔含藥血清， 用血小板聚集功能測定法觀察GK含藥血清對PAF誘導的家兔血小板聚集的影響。建立缺糖缺氧復氧（OGD/R）細胞模型，采用Hoechst/PI雙染考察不同濃度的GK對OGD/R損傷的SH-SY5Y細胞凋亡的影響；建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型（I/R），檢測GK對神經行為評分及腦梗死體積的影響。GK能劑量依賴性的抑制PAF誘導的血小板聚集，逆轉OGD/R損傷造成的細胞凋亡并改善大鼠腦缺血再灌注損傷后的神經行為評分及腦組織梗死體積。GK能抑制PAF誘導的血小板聚集、改善腦缺血再灌注神經損傷。

[關鍵詞] 銀杏二萜內酯K； 血小板活化因子； 細胞凋亡； 缺血再灌注

[Abstract] To investigate the antagonism effects of different concentrations of ginkgolide K（GK） on platelet activating factor （PAF）-induced platelet aggregation and neuroprotective effect on cells and animal models of ischemia-reperfusion injury. GK-containing serum in rabbit was prepared， and the effects of GK-containing serum on PAF-induced platelet aggregation was observed by platelet aggregation assay. The effect of different concentrations of GK on apoptosis of SH-SY5Y cells injured by oxygen-glucose deprivation/reoxygenation （OGD/R） was investigated by Hoechst 33342/PI double staining in OGD/R cell model. The focal cerebral ischemia-reperfusion model （I/R）was established in rats to detect the effects of GK on neurobehavioral scores and cerebral infarction volume. GK could inhibit PAF-induced platelet aggregation， reverse the apoptosis induced by OGD/R injury and improve the neurobehavioral score and cerebral infarction volume after cerebral ischemia-reperfusion injury in rats in a dose-dependent manner. GK can inhibit PAF-induced platelet aggregation and improve nerve injury after cerebral ischemia-reperfusion.

[Key words] ginkgolide K； platelet activating factor； apoptosis； ischemia reperfusion

銀杏二萜內酯是銀杏葉提取物中治療急慢性腦功能不全及其后遺癥的一類主要有效物質，目前從中已鑒別出的成分包括銀杏二萜內酯A，B，C，M，J，L，P，Q[1]，從結構上來屬于具有共同母核結構的二萜內酯類成分。前期藥理研究報道證實，銀杏二萜內酯是具有高度專屬性的、天然的血小板活化因子（PAF）受體拮抗劑，能明顯抑制由PAF誘導的血小板聚集，防止血栓形成?？捎糜谀X卒中、神經系統疾病等疾病的治療[2-3]，尤其是銀杏二萜內酯B（ginkgolide B，GB） 被證實是最有效的PAF受體拮抗劑[4]。此外，部分研究還發現銀杏二萜內酯類成分對損傷的神經元具有保護作用，能改善急慢性腦功能所導致的記憶減退和癡呆等后遺癥[5-6]。因此，銀杏葉中的二萜內酯類成分對急慢性腦功能不全疾病發展過程中的血小板聚集和神經損傷方面比較好的改善作用。

銀杏二萜內酯K（ginkgolide K，GK）為銀杏葉中提取到的新的二萜類成分[7]，其結構與目前已知的銀杏葉中二萜內酯類成分具有共同的母核結構。因此，基于“相似結構的成分可能具有類似的藥理活性”，推測GK可能具有類似的抗血小板聚集和改善急慢性腦功能不全中神經損傷的作用。為此，本文通過建立PAF誘導的血小板聚集及體內外模擬缺血缺氧再灌注模型研究GK的抗血小板聚集和神經保護活性。

1 材料

1.1 動物及細胞株

新西蘭家兔，體質量（2.0±0.2） kg，雌雄各半，購自南京市江寧區青龍山動物養殖場提供，許可證號SCXK（蘇）2012-0008；SD大鼠，雄性，250～280 g，浙江省實驗動物中心，許可證號SCXK（浙）2014-0001；人神經母細胞瘤細胞（SH-SY5Y）購于中國科學院上海細胞庫。

1.2 藥品與試劑

GK和GB（自制，純度≥90%）；血小板活化因子（PAF，批號BCBM4010V）、Hoechst33342（批號021206）、Propidium iodide（PI，批號094K3731）、2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，批號T8877-100g）購于Sigma公司； RPMI 1640 培養基（批號1165062）、胎牛血清（批號1403447）購于Gibco公司；銀杏提取物注射液（EGB，金納多注射液，批號6580199）購于德國舒培大藥廠；水合氯醛（批號20140827，國藥集團化學試劑有限公司）；其他試劑均為分析純。endprint

1.3 儀器

LG-PABER-I 血小板聚集凝血因子分析儀（北京世帝科學儀器公司）；80-2臺式低速離心機[上海醫療器械（集團）有限公司手術器械廠]；Artorius分析天平（北京多利斯天平有限公司）；SW-CJ-2F超凈工作臺（上海博訊實業有限公司）；3111型二氧化碳培養箱（Thermo公司）；XDS-1型倒置顯微鏡（重慶光學儀器廠）；countess細胞自動計數儀（Invitrogen公司）；LDZ5-2型離心機（北京京力離心機有限公司）；Image Xpress高內涵設備（MD公司）。

2 方法

2.1 GK對PAF誘導家兔血小板聚集的影響

2.1.1 藥品配制 GK和GB使用前用0.5%葡甲胺80 ℃水浴溶解，10%檸檬酸水溶液調節pH至8.0，用江蘇康緣藥業股份有限公司提供的銀杏二萜內酯葡胺注射液溶媒（含0.5%葡甲胺與0.15%檸檬酸）定容，微孔濾膜過濾，4 ℃保存1 周內用完；臨用前以無菌生理鹽水稀釋至所需濃度；銀杏提取物注射液（EGB），規格 17.5 mg，銀杏提取物5 mL/支，取1支進行1.5倍稀釋，作為大鼠腦缺血再灌注模型給藥。

2.1.2 含藥血清的制備 30 只新西蘭家兔，雌雄各半，根據體質量隨機分為6組： GKⅠ（0.01 mg·kg-1）組、GKⅡ（0.04 mg·kg-1）組、GKⅢ（0.16 mg·kg-1）組、GKⅣ（1 mg·kg-1）組、GB（4 mg·kg-1）和生理鹽水組。耳緣靜脈注射給藥，每組動物分別給予相同體積的藥物或生理鹽水0.5 mL·kg-1，1 次/d，連續5 d，末次給藥前禁食12 h，藥后2 h 取耳中央動脈血10 mL，室溫靜置2 h，離心（4 ℃，2 500 r·min-1，10 min）分離后的家兔血清于56 ℃水浴中30 min 滅活，分裝，-70 ℃冰箱凍存備用。

2.1.3 家兔洗滌血小板懸液的制備 家兔用利多卡因局部麻醉，手術分離頸總動脈取血，采取3.8%枸櫞酸鈉1∶9抗凝，以500 r·min-1離心10 min，取上層富含血小板血漿，加等體積的磷酸緩沖液（KH2PO4 0.22 g，Na2HPO4 0.86 g，檸檬酸0.86 g，葡萄糖0.44 g，溶于500 mL 蒸餾水中，pH 6.5）混勻，在4 ℃，以3 000 r·min-1離心10 min，取沉淀，用等體積的磷酸緩沖液混勻，4 ℃，3 000 r·min-1離心5 min 后棄上清，取血小板沉淀，重復洗滌1 次；取沉淀的血小板加入含有0.1 %小牛血清和1 mmol·L-1的MgCl2的磷酸緩沖液中，稀釋成（2.5～6）×107 mL-1的洗滌血小板懸浮液（WP）備用。

2.1.4 含藥血清對PAF誘導的血小板聚集作用的影響 取WP 200 μL 和樣品（對照管加入生理鹽水，給藥管加入相同體積的含藥血清）50 μL 混勻，溫孵5 min 后，以5 μL PAF（終濃度為1×10-4 mol·L-1）為誘導劑，觀察WP在5 min 內的聚集程度，測定5 min內最大聚集率。每個樣品平行作3管，取均值，并與對照管比較，計算含藥血清對PAF 誘導的家兔血小板的聚集抑制率。

血小板的聚集抑制率= （對照組5 min內最大聚集率-待測樣品組5 min內最大聚集率）/對照組5 min內最大聚集率×100%

2.2 GK對缺糖缺氧損傷的SH-SY5Y細胞的影響

2.2.1 細胞培養，OGD/R 模型和給藥SH-SY5Y 細胞培養于RPMI 1640 培養基（含體積分數為10%胎牛血清，100 kU·L-1青霉素，100 mg·L-1鏈霉素） 中，置于37 ℃，含5% CO2的細胞培養箱中培養，選取對數生長期細胞進行實驗。將SH-SYSY 細胞接種至細胞板中培養24 h，以無糖平衡鹽溶液完全置換RPMI 1640 培養基置于缺氧小室中，將小室用95% N2和5% CO2混合氣，以20 L·min-1的氣流速度充氣20 min 以排出空氣，密封小室，將小室和對照組細胞置于37 ℃，5% CO2的細胞培養箱中。將細胞在缺氧小室中培養一定的時間后，取出細胞板置于細胞培養箱中，和GK，EGB藥物一起復氧一定時間，然后進行Hoechst33342/PI染色檢測細胞凋亡。

2.2.2 Hoechst33342/PI雙染 將SH-SY5Y 細胞以每孔2×104的密度接種至96 孔板中，OGD 4 h 后加入終濃度為5，20，80 μmol·L-1的GK和25 mg·L-1的EGB，一起復氧1 h 后，棄掉板中所有液體，無血清培養基洗板1次，各孔加入100 μL的 Hoechst33342/Propidium iodide 染液（Hoechst33342終質量濃度10 mg·L-1，Propidium iodide 終質量濃度15 mg·L-1，體積比為1∶1），避光，放入細胞培養箱中孵育0.5 h 后，無血清培養基洗板一次，每孔加入100 μL 無血清培養基，高內涵設備拍照（4×，4 視野/孔），進行數據分析，計算陽性細胞率，即PI染色數/Hoechst染色數×100%。

2.3 GK對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的神經保護作用

2.3.1 動物分組及模型構建 SD大鼠80只，隨機分為假手術（Sham） 組、I/R 組、GKⅠ（0.02 mg·kg-1）組、GKⅡ（0.1 mg·kg-1）組、GKⅢ（0.5 mg·kg-1）組、GKⅣ（2 mg·kg-1）組、GKⅤ（4 mg·kg-1）組、EGB（8 mg·kg-1） 組，每組10只。其中給藥組在大鼠造模完成后次日給予尾靜脈注射治療，3 mL·kg-1，每天1次，共3 d。

取大鼠用10%水合氯醛（35 mg·kg-1，3.5 mL·kg-1）腹腔注射麻醉大鼠、仰臥位固定、備皮、碘伏消毒，頸部正中略偏右0.5 cm縱行切口，切口長約2.5 cm，鈍性分離皮下結締組織和肌肉，游離右側頸總動脈（common carotid artery，CCA）、頸外動脈（external carotid artery，ECA）和頸內動脈（internal carotid artery，ICA）。在頸外動脈遠心端結扎，并用電凝筆凝斷，留一殘端；在頸外動脈上剪一小口插入栓線，栓線沿頸外經過分叉處、頸內動脈緩慢送往顱內至大腦中動脈的起始部位，以阻斷中動脈的血流，進線長度自頸總動脈分叉處18～20 mm，在剪口處結扎固定栓線；將手術大鼠放在加熱器前保溫，缺血90 min時用乙醚麻醉，輕輕拔出栓線，ECA殘端結扎，縫合大鼠。假手術組操作同上，僅暴露各組血管，而不進行線栓插入。endprint

2.3.2 神經功能缺失體征評分 參考Longa及Bederson的5分制法72 h進行評分。神經功能完全正常為0分；提起鼠尾，手術對側前肢屈曲，無法完全伸直為1分，軀體向手術對側扭轉為2分；將鼠置于地面，行走時向手術對側轉圈為3分，向手術對側傾倒或無法自主行走，意識障礙為4分；死亡為5分。分值越高，說明動物行為障礙越嚴重。

2.3.3 腦梗死面積檢測 脫頸椎處死大鼠，開顱取腦組織（去除嗅球、小腦、低位腦干），稱濕重，將腦組織放入-20 ℃冰箱中速凍20 min，稍硬便于切片；切成6片，每隔2 mm切1片。第一刀在腦前極與視交叉連線中點處，第二刀在視交叉部位，第三刀在漏斗柄部位，第四刀在漏斗柄與后葉尾極之間；將腦片置于TTC中，37 ℃避光染色30 min，間隔15 min翻轉腦片，用甲醛置換染液固定腦片；3 h后，拍照。

2.4 數據處理

資料數據以±s表示，所有數據采用SPSS 16.0統計學軟件進行分析，用One-way ANOVA檢驗進行單因素方差分析。

3 結果

3.1 GK對PAF誘導家兔血小板聚集的影響

與生理鹽水組相比，GKⅠ-Ⅳ組各含藥血清能明顯抑制PAF誘導的血小板聚集（P<0.01），并呈劑量依賴性，隨著藥物濃度的提高，對血小板聚集的抑制作用逐漸增強，且抑制效果優于GB組，見表1。

3.2 GK對缺糖缺氧損傷的SH-SY5Y細胞的影響

OGD/R（模型組）的陽性細胞率高達48%，與溶劑對照組（2.33%）相比，細胞調亡顯著（P<0.01），造模成功；與模型組相比，GK各劑量組與EGB組均能顯著逆轉缺氧復氧造成的細胞凋亡（P<0.01），且GK有明顯的劑量依賴關系，見圖1，2。

3.3 GK對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的神經保護作用

3.3.1 神經功能缺失體征評分 GKⅠ～Ⅴ組和 EGB組大鼠神經功能缺失體征評分較I/R組（模型組）大鼠均有顯著的降低，且差異有統計學意義（P<0.05或P<0.01），GK存在明顯的量效關系；當GK上升到較大濃度（4 mg·kg-1）時，其活性基本處在一個平臺期，見表2。

3.3.2 腦梗死面積檢測 大腦經TTC染色后，正常腦組織呈鮮紅色，而梗死組織則呈白色，且界限分明。TTC染色結果見圖3，與假手術組相比，I/R組、GKⅠ～Ⅴ組和EGB組均出現不同程度的腦梗死，說明模型造模成功。而與I/R組相比，GKⅠ～Ⅴ組和EGB組大鼠的腦梗死面積均有明顯減?。≒<0.05或P<0.01），見表3。

4 討論

血小板聚集是指血小板被活化后相互之間黏附形成聚集物的現象，是形成血栓的重要原因。在腦缺血發生時，PAF可以激活和聚集血小板，并釋放血管活性物質如組織胺、白三烯等，進一步加重腦水腫以及血管栓塞；PAF可以使神經元膜內外離子失衡，導致其功能紊亂，產生細胞源性腦水腫，同時可以阻斷神經元內線粒體的氧化磷酸化作用，導致神經元的死亡[8]；PAF能夠趨化并激活白細胞釋放炎性介質，同時還可刺激白細胞產生自由基，二者相互作用能夠加重組織損傷并且加速炎癥進展[9]；PAF還能夠加重興奮性氨基酸毒性，對神經細胞造成進一步損傷[10]。PAF的上述作用相互影響，互相促進，從而在腦缺血發生時形成惡性循環，進一步加重腦損傷。PAF主要是通過與細胞膜表面的PAF 受體結合而發揮生物效應，PAF受體拮抗劑則能拮抗或阻斷PAF 與受體結合，阻止PAF發揮生物學效應[11]。GB為公認的的PAF受體拮抗劑，對PAF誘導的血小板聚集有明顯的抑制作用[12]。本研究發現：含GK藥物血清對PAF誘導的洗滌血小板聚集的抑制作用明顯增強且在小劑量（0.01～0.16 mg·kg-1）

下存在明顯的劑量依賴關系，隨著劑量增加到1 g·L-1，抑制活性依然呈上升趨勢但增加幅度降低。提示GK可能也是一種PAF受體的拮抗劑，且活性優于陽性藥GB。

GK既然對血小板聚集有一定的抑制作用，推測對腦缺血損傷可能也存在保護作用。本研究建立體外細胞和體內動物模型來模擬缺血缺氧再灌注損傷來闡述GK在神經保護方面的作用。SH-SY5Y細胞的OGD 模型是模擬缺血性腦卒中的經典模型，已成為離體水平研究腦缺血損傷機制及藥物作用的重要手段。熒光染料 Hoechst 33342 是一種可以穿透細胞膜，嵌入細胞核 DNA 的細胞核染料，能少量進入平常的細胞膜，使其染上低藍色，凋亡的細胞呈亮藍色，碘化吖啶（propidium iodide，PI）不能通過活細胞膜，但卻能穿過損壞的細胞膜而對核染色，即壞死細胞可被 PI 著色，呈紅色。二者的比值（在此用細胞陽性率表示）在一定程度上可以代表細胞的凋亡程度。本研究發現，SH-SY5Y 細胞OGD/R損傷后，與對照組比，陽性率明顯升高，說明細胞凋亡水平明顯增加。GK可濃度依賴性地提高OGD/R損傷神經細胞的活性，明顯降低OGD/R神經細胞的凋亡。說明GK可以抑制神經細胞的凋亡。有研究報道，GK可以通過減少ROS產生及Ca2+內流來保護PC12細胞抵抗谷氨酸誘導的損傷，同時還可以降低MDA含量，caspase-3和下調Bax/Bcl-2比值以及減少LDH的釋放及抑制細胞色素C從線粒體釋放到細胞質[13]。GK對于H2O2誘導的PC12損傷的保護機制[14]也與上述基本一致，有可能GK對OGD/R損傷SH-SY5Y細胞的存在相似的保護機制，但仍需要做進一步的研究證實。

腦缺血再灌注損傷后神經細胞損傷主要包括壞死和凋亡。腦梗死中心區細胞迅速壞死，周圍缺血半暗帶內的細胞則代謝反應性增加，易于受到繼發的炎性反應、水腫、鈣超載及過氧化物損害等而發生凋亡，如不及時糾正，半暗帶區將難以避免成為永久性梗死灶的一部分[15]。因此，減少缺血早期梗死邊緣區神經細胞的凋亡，是治療腦缺血疾病的關鍵。缺血發生后，SOD活性降低，MDA含量升高，大量氧化產物降低線粒體膜電位，誘導Ca2+內流，進而改變線粒體通透性，釋放相應的凋亡因子，如細胞色素C，AIF因子等，促進細胞下游凋亡因子caspase-3蛋白的過多表達，最終，破壞DNA的完整性，引起細胞凋亡[16]。本實驗研究顯示，與模型組比較，GK各劑量組大鼠神經功能行為學評分、腦梗死體積呈顯著性降低。表明GK能改善I/R大鼠神經功能，減少腦缺血后神經損傷。endprint

綜合以上研究結果，GK通過拮抗PAF的生物效應來抑制血小板聚集以及后續級聯反應來降低腦缺血再灌注后造成的神經損傷并抑制腦缺血再灌注后細胞凋亡來保護神經元的損傷從而達到治療腦缺血的目的。

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[責任編輯 孔晶晶]endprint