異牡荊素對大鼠心室肌細胞瞬時外向鉀電流的影響

任靜娜+饒本龍+馬宏昕+沙毛毛+匡怡+許正新

[摘要] 探究異牡荊素對大鼠心室肌細胞瞬時外向鉀通道電流的影響。該實驗采用MTT檢測法探究異牡荊素的安全范圍，結果顯示該藥物的IC50 10～30 μmol·L-1，而膜片鉗實驗所選用的藥物濃度1～3 μmol·L-1均在該安全范圍之內。此外，采用主動脈逆行灌流單酶解法得到單個心室肌細胞，應用全細胞膜片鉗技術引導、記錄大鼠心室肌細胞瞬時外向鉀電流（Ito）并分析在給予異牡荊素（IV）前后該電流特征的變化。當IV終濃度低于0.1 μmol·L-1時，其對Ito無明顯影響，但隨著濃度的升高（≥0.3 μmol·L-1），Ito峰值逐漸降低[由給藥前的（32.32±2.9） pA/pF分別降為（25.83±4.3） pA/pF，1 μmol·L-1 IV和（19.51±3.5） pA/pF，3 μmol·L-1 IV]，呈現出濃度依賴性抑制現象。在1～3 μmol·L-1濃度內，IV使Ito的I-V曲線明顯下移。激活曲線結果顯示，IV可使最大半數激活電位（V1/2）向正值方向移動[給藥前V1/2為（19.59±1.6） mV，給藥后V1/2分別升高（22.81±1.7） mV，1 μmol·L-1 IV；（28.86±1.4） mV，3 μmol·L-1 IV]，同時激活曲線右移。Ito穩態失活曲線的最大半數失活電位（V1/2）：給藥組（-61.81±1.3） mV，1 μmol·L-1和（-71.50±1.4） mV，3 μmol·L-1較給藥前（-51.43±0.99） mV顯著降低。而就失活后恢復曲線的失活時間常數（τ）而言，給藥后的τ較給藥前明顯升高[給藥前（94.89±0.73） ms；給藥后（118.5±1.5） ms，1 μmol·L-1；（162.4±1.4） ms，3 μmol·L-1]，IV使Ito的失活后恢復曲線右移，提示其能延長瞬時外向鉀通道的失活后恢復時間。異牡荊素對大鼠心室肌細胞的Ito具有明顯的抑制作用。

[關鍵詞] 乳鼠； 異牡荊素； 心室肌細胞； 膜片鉗； 2相折返； 瞬時外向鉀電流

[Abstract] To investigate the effects of isovitexin Ⅳ on transient outward potassium current in rat ventricular myocytes. In this study， MTT assay was used to investigate the safe range of isovitexin. The results showed that the IC50 of the drug was in the range of 10-30 μmol·L-1， and the drug concentration of 1-3 μmol·L-1 for the patch clamp test was within the safe range. In addition， the single ventricular myocytes were obtained by single-enzymatic hydrolysis through aortic retrograde perfusion. The transient outward potassium current （Ito） of rat ventricular myocytes was guided and measured by whole-cell patch-clamp technique and the changes of current characteristics were recorded after isovite was applied. When the concentration of IV was less than 0.1 μmol·L-1， there was no significant effect on Ito. However， with the increase in the concentration of IV （≥0.3 μmol·L-1）， the peak of Ito was decreased gradually， from （32.32±2.9） pA/pF to （25.83±4.3） pA/pF， 1 μmol·L-1 IV and （19.51±3.5） pA/pF， 3 μmol·L-1 IV respectively， with an inhibition effect in a concentration-dependent manner. In the range of 1-3 μmol·L-1， IV down-regulated the I-V curve of Ito significantly. The activation curve showed that IV can enable the maximum half activation potential （V1/2） to move to the positive direction， and the V1/2 was increased from （19.59±1.6） mV to （22.81±1.7） mV and （28.86±1.4） mV at concentration of 1， 3 μmol·L-1， meanwhile the activation curve moved to the right. However， the maximum half inactivating potential （V1/2） of the steady-state inactivation curve of Ito was significantly decreased from （-51.43±0.99） mV to （-61.81±1.3） mV with concentration of 1 μmol·L-1 and （-71.50±1.4） mV with concentration of 3 μmol·L-1. The inactivation time constant of recovery from inactivation （τ） was up-regulated significantly from （94.89±0.73） ms to （118.5±1.5） ms and （162.4±1.4） ms at concentration of 1， 3 μmol·L-1respectively. Meanwhile IV could enable the inactivation recovery curve to move to the right， which suggested that it can prolong the recovery time from inactivation of the transient outward potassium channel. In conclusion， isovitexin had a high inhibitory effect on Ito in rat ventricular myocytes.endprint

[Key words] neonatal rat； isovitexin； ventricular myocytes； patch clamp； phase 2 reentry； transient outward potassium current

黃酮類化合物（flavonoids） 是植物的次生代謝產物，包括多種氧苷黃酮和碳苷黃酮。碳苷黃酮是指糖基以C-C鍵直接連接在黃酮母體上[1]，文獻報道，該類化合物具有舒張血管、抗癌、抗血小板和抗心律失常等一系列作用[2-4]。從結構上來看，異牡荊素（isovitexin，IV）屬于碳苷黃酮類活性物質，廣泛存在于自然界幾十種植物的根、莖、葉、樹皮、果實和種子中?，F有的相關數據顯示，IV具有多種藥理學活性，包括降血糖[5]、抗菌[6]、調節記憶[7]、抑制α-葡萄糖苷酶[8]、降血壓和抗氧化[9-10]等作用。但有關該化合物其他方面的作用則尚未見專門的研究，這為作者繼續深入探究提供了空間。本實驗擬從離子通道方面著手，利用細胞膜片鉗技術，探討IV對急性分離大鼠心室肌細胞中瞬時外向鉀電流（transient outward potassium current，Ito）的影響，繼而對IV的藥理學機制作一個判斷和評價。

1 材料與方法

1.1 動物 SD大鼠，體質量180～300 g和出生1～3 d內的SD乳鼠均由揚州大學比較醫學中心提供，雌雄不限。

1.2 藥品與試劑 異牡荊素購自成都普思生物科技有限公司，膠原酶Ⅱ購自Worthington公司，glucose，Taurine，HEPES購自美國Sigma公司，其余均為國產分析純。胰酶細胞消化液購于碧云天生物技術公司，DMEM和胎牛血清（FBS）均購于美國 HyClone公司。

1.3 試劑配制 無鈣臺氏液：NaCl 136 mmol·L-1，KCl 5.5 mmol·L-1，NaH2PO4 0.3 mmol·L-1，MgCl2 1.0 mmol·L-1，HEPES 5.0 mmol·L-1，glucose 10.9 mmol·L-1。用NaOH調pH 7.35～7.40。臺氏液：無鈣臺氏液中加1.8 mmol·L-1CaCl2即可。酶液：無鈣臺氏液中加0.4 g·L-1膠原酶Ⅱ，1 g·L-1BSA，0.4 g·L-1 taurine，30 μmoL的CaCl2。KB液：L-glutamic acid 70.0 mmol·L-1，taurine 10.0 mmol·L-1，KCl 25.0 mmol·L-1，NaH2PO4 10.0 mmol·L-1，EGTA 0.5 mmol·L-1，glucose 11.0 mmol·L-1，HEPES 5.0 mmol·L-1，KOH 89.0 mmol·L-1，用KOH調pH 7.35～7.40。電極內液：KCl 40.0 mmol·L-1，MgCl2 1.0 mmol·L-1，K2ATP 5.0 mmol·L-1，K-aspartate 106.0 mmol·L-1，EGTA 10.0 mmol·L-1，HEPES 5.0 mmol·L-1，用KOH調pH 7.30。細胞外液：臺氏液。

1.4 乳鼠心室肌細胞分離及培養[11] 取乳鼠8只常規皮膚消毒，在無菌條件下開胸取心室組織，用4 ℃ PBS沖洗2～3次，剪成1 mm3的小塊，加4 mL 0.25%胰酶，在37 ℃水浴中分4次消化，每次約10 min。收集除第1次以外的細胞懸液于離心管中，加入適量含胎牛血清的培養基，終止胰酶對細胞的酶解作用，經200目濾網過濾，去除未消化組織及細胞團。離心5 min棄上清液，用含10%胎牛血清的DMEM培養基制成細胞懸液后接種于培養皿中，放置37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱中孵育1.5 h后棄貼壁細胞，獲得高純度的心室肌細胞。

1.5 細胞活力檢測試驗（MTT試驗） 將乳鼠心室肌細胞消化成單細胞懸液，每孔100 μL接種到96孔培養板中，鋪板使待測細胞密度為8 000～1萬個/孔，然后置于培養箱中培養過夜。向96孔板中加入不同濃度的IV，共5組（分別為0，1，3，10，30 μmol·L-1），每組5個復孔，分別孵育24，48 h后，每孔加10 μL MTT溶液（5 g·L-1）；培養4 h后吸棄上清液，每孔加100 μL DMSO，在搖床上低速振蕩10 min后用酶標儀測定490 nm波長處吸光度A490，試驗重復3次，取平均值。

1.6 大鼠心室肌細胞的分離 大鼠心室肌細胞的分離參照有關報道[12]并有所改良。大鼠腹腔注射肝素2 000 IU·kg-1，約10 min后再腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1），麻醉成功后迅速開胸，取出心臟，置于4 ℃無鈣臺氏液中進行清洗，簡單修剪后將主動脈插入改良過的Langendorff灌流架上結扎固定。先臺氏液灌流使心臟復跳30 s排除內部血污，隨后換用無鈣臺氏液灌流5～10 min，再用含鈣的酶溶液灌流20～30 min，直至心臟開始明顯脹大、透明、滴出液變渾濁、切塊鏡檢時出現長桿狀細胞為止迅速終止消化。整個灌流過程保持恒溫37 ℃及持續充氧。消化停止后迅速剪下心室組織，在KB液中剪碎、過濾，濾液置室溫，靜置10 min后棄上清液，KB液清洗，如此反復3次，然后避光室溫放置2～3 h備用。

1.7 全細胞膜片鉗記錄 將心室肌細胞置于培養皿中，細胞外液灌流10 min。待其貼壁后，在倒置顯微鏡下選擇長桿狀、橫紋清晰、立體感強的細胞進行后續的一系列操作。所有實驗均在室溫下進行。

1.8 電極等試驗條件 試驗中使用的玻璃微電極由程序化的P-97水平拉制儀拉制而成，主要使用參數為電極入液后電阻保持在2～4 MΩ，串聯電阻補償為60%～70%。

1.9 統計分析 采用PatchMaster軟件采集所記電流，用Origin 7.0軟件對實驗數據進行轉換并結合Graphpadprism 6.1對數據進行分析和擬合。使用SPSS 16.0軟件對實驗數據進行統計處理，所有實驗數據均以±s表示，統計學檢驗的標準為P<0.05。endprint

2 結果

2.1 IV對乳鼠心室肌細胞活力的影響 為了探討IV對心室肌細胞活力是否有影響，本研究采用MTT法檢測不同濃度的IV處理前后的細胞活力，見圖1。當細胞培養至24 h時，與對照組相比，IV濃度在0～3 μmol·L-1細胞活力均無明顯下降；然而當濃度增加至10～30 μmol·L-1時，細胞活力逐漸降低（P<0.01），說明此濃度范圍的IV對細胞有一定的毒性。當細胞培養至48 h時，與對照組相比，IV濃度在0～3 μmol·L-1細胞活力逐漸降低（P<0.05）；當IV濃度達到30 μmol·L-1時，細胞活力下降尤為顯著（P<0.01），提示此濃度范圍的藥物對細胞產生的毒性較大。綜上可知，細胞活力隨藥物濃度的增加和時間的延長而逐漸降低，并且IV的IC50可能在10～30 μmol·L-1。

2.2 IV對大鼠心室肌細胞Ito的影響 為了探究IV是否能對Ito產生影響，本實驗采用方波單刺激方案。在電壓鉗模式下，保持電位-80 mV，給予70 mV、持續時間300 ms的方波單刺激，見圖2。結果表明，給予Ito的特異性阻滯劑（2 μmol·L-1 4-AP）后，電流幾乎被完全抑制，表明所記錄到的電流是Ito，而與給藥前（對照組）相比，IV濃度為1 μmol·L-1時，Ito明顯減?。≒<0.01），提示IV對Ito具有顯著的抑制作用。

2.3 不同濃度的IV對Ito的影響 為了進一步闡明以上抑制作用與藥物濃度大小的相關性，本實驗采取累積加藥法給藥10 min后觀察不同濃度的IV對心室肌細胞Ito的影響（0.1，0.3，1，3，10 μmol·L-1），刺激方案同2.2項。結果表明，當Ⅳ的濃度為0.1 μmol·L-1時，其對Ito無明顯影響，而濃度增加到0.3 μmol·L-1時，則呈現出較弱的抑制作用。隨著藥物濃度的持續增加（≥1 μmol·L-1），IV的抑制作用逐漸增強，其中，1，3 μmol·L-1 IV使Ito的峰值電流密度由給藥前的（32.32±2.9） pA/pF分別降為（25.83±4.3），（19.51±3.5） pA/pF （P<0.01），見圖3。由此說明，IV對Ito的抑制具有濃度依賴性。

2.4 IV對Ito電流-電壓（I-V）曲線的影響 在電壓鉗模式下，保持電位-80 mV，給予-50～70 mV、階躍10 mV、持續時間500 ms的方波串刺激，刺激頻率0.5 Hz，記錄給藥前后的Ito，以電流密度對相應的膜電位作圖繪制出Ito的I-V曲線，見圖4。結果顯示，與給藥前（對照組）相比，IV濃度為1 μmol·L-1時，Ito的峰值電流密度明顯減少（P<0.01），并且隨著膜電位的增加而逐漸升高；而濃度為3 μmol·L-1時，也表現出相同的趨勢；兩給藥組間相比，當IV為3 μmol·L-1時，Ito的峰值電流密度被抑制的更為顯著。隨后采用正常細胞外液進行洗脫，此時Ito的峰值電流密度較加藥組有所回升，表明Ito的抑制效應是IV直接作用的結果。提示IV對Ito具有明顯的抑制作用。

2.5 IV對Ito激活動力學特性的影響 為了闡明IV對Ito的激活過程有沒有影響，考察觀察不同濃度的IV給藥前后Ito激活曲線的變化。由于在前述的實驗中1，3 μmol·L-1的IV能明顯地對Ito產生影響，因此，后續的給藥方案即以此2個藥物濃度為參考。刺激方案同2.4項，采用Boltzmann方程I/Imax=1/{1+exp [（V1/2 -V）/k]}對所得實驗數據進行擬合，得到穩態激活曲線，其中，V1/2為半數激活電位，k為斜率，I為測試脈沖引出的峰電流值，Imax為最大峰電流值，見圖5。不同濃度的IV均能使Ito的激活曲線明顯右移。其中，給藥前V1/2為（19.59±1.6） mV，給予1 μmol·L-1的IV后，V1/2變為（22.81±1.7） mV；而給予3 μmol·L-1的IV，V1/2升高到（28.86±1.4） mV（P<0.01）。V1/2向正值方向移動，表明藥物可以使Ito不易被激活。

2.6 IV對Ito失活動力學的影響 采用雙脈沖刺激法，保持電位-80 mV，條件脈沖從-120 mV開始逐步去極化至30 mV，階躍10 mV，持續時間1 000 ms，然后再給一去極化至70 mV，持續時間300 ms的測試脈沖，采用Boltzmann方程進行擬合，得到穩態失活曲線，其中，V1/2 為半數失活電位，k為斜率因子，見圖6，表1。結果顯示，IV能使Ito的失活曲線顯著左移，即向超極化方向移動，1 μmol·L-1的IV使V1/2由給藥前的（-51.43±0.99） mV降為（-61.81±1.3） mV，而使3 μmol·L-1的IV降至（-71.50±1.4） mV（P<0.01）；另外，1，3 μmol·L-1的IV可使k由給藥前的（16.65±0.88）分別變為（14.01±1.2），（10.98±1.3） （P<0.01）。結果表明，IV可明顯改變Ito的失活動力學特征，加快Ito的失活。

2.7 IV對Ito失活后恢復動力學的影響 前述實驗結果已經表明IV可明顯加快Ito的失活，本實驗采用雙脈沖刺激法，保持電位-80 mV，給予去極化至70 mV的刺激，持續200 ms，回到保持電位持續50 ms后，再給予去極化至70 mV，200 ms的刺激，前后2個脈沖的間隔時間以50 ms的幅度逐漸增加，共20個脈沖；用單指數方程I/Imax =1-exp（-t/τ）擬合，τ為失活時間常數，見圖7，表1。結果顯示，IV可使Ito的失活后恢復曲線明顯右移，其中，對照組τ=（94.89±0.73） ms；IV組中1 μmol·L-1 IV，τ=（118.5±1.5） ms；3 μmol·L-1 IV，τ=（162.4±1.4） ms，P<0.01。相比較而言，1 μmol·L-1的IV對Ito的失活后恢復曲線影響較小，而3 μmol·L-1的IV可明顯改變Ito的失活后恢復動力學特征，使Ito失活后恢復的時間延長，這種電生理作用具有潛在的應用價值和臨床意義。endprint

3 討論

心肌細胞中鈉、鉀、鈣等離子通道保持動態平衡是心臟正常工作的基礎，當離子通道間平衡失調將導致心肌電信號傳導紊亂，進一步誘發心律失常[13]。研究表明，鉀通道是抗心律失常藥物作用的一個重要靶點[14]，在調節細胞興奮性、膜電位及收縮舒張活動中具有重要作用，而Ito主要參與心肌細胞動作電位l相復極，其電流幅值及動力學特征的改變可間接影響到其他通道電流的激活和失活過程，進而對動作電位的形態和時程產生一定的影響[15]。大量研究顯示Ito在心房顫動、心力衰竭、心肌梗死等多種心血管系統疾病的發展過程中出現功能異常，并且常伴有心律失常并發癥[16-18]。因此探究Ito的異常變化可以為今后治療心臟疾病及抗心律失常藥物的研發提供理論依據和臨床用藥指導。

本項研究對黃酮類化合物IV在大鼠心肌細胞上瞬時外向鉀通道電流特性進行分析，結果表明，IV對Ito的電流幅值有明顯的抑制作用，使I-V曲線下移且抑制作用呈明顯的濃度依賴性，進而導致心肌細胞外向鉀電流減少。有研究顯示，Ito在心臟的分布具有明顯的異質性，其密度增加可導致心外膜心肌細胞復極離散度增大而引起2相折返，誘發致命性的室性心律失常[19-20]；而IV對Ito的抑制作用可能會通過延長動作電位復極時間及有效不應期，減少跨壁復極不均一性，扭轉2相折返，避免心律失常的發生。此外，在心肌細胞Ito的恢復和失活過程中也有可能激發2相折返，而Ito的激活、失活和失活后恢復等各項動力學特征的改變可影響心肌細胞電生理特性。本研究結果顯示，IV抑制電流的效應與Ito激活有關，給藥后發現，Ito穩態激活曲線向膜電位的正值方向移動，半數激活電壓遠離靜息膜電位，使通道不易被激活；而給藥組的失活曲線左移，加快Ito的失活，并延長失活通道的恢復時間，減緩Ito從失活態到靜息態的恢復過程；以上幾個動力學參數的改變均對瞬時外向鉀通道有影響，因此作者認為，IV可能通過減少瞬時外向鉀通道的開放頻率而抑制Ito。

有研究證實[21]IV是一種安全性高的藥物，該藥可以快速地分布于身體的各個組織中，隨著時間的延長，大多數組織中的藥物濃度會顯著降低，表明該藥物并不會在體內長期積累而引發毒性反應，這為該藥在后續的研發中提供了安全性的依據。另外，MTT實驗結果也證實了IV的IC50在10～30 μmol·L-1，而膜片鉗實驗所用藥物濃度（1～3 μmol·L-1）在安全范圍之內，因此，可以證明Ito的抑制效應是藥物作用的結果而不是細胞毒性所引起的。本實驗首次采用全細胞膜片鉗技術研究IV對心肌細胞離子通道的作用特性來評估其對大鼠心臟電生理的影響，但對瞬時外向鉀通道相關基因和蛋白的表達尚未涉及，因此，IV對鉀通道影響的具體調控機制還不清楚。為了進一步探討IV的藥理學特性和體內作用機制，今后還需在病理模型上就該藥物對鉀通道的其他亞型進行相關實驗研究，從而為該藥的深入開發及能否作為抗心律失常藥物提供直接的證據和相關的理論指導。

[參考文獻]

[1] 邵瑩，吳啟南，樂巍，等. 碳苷黃酮保護心肌缺血損傷作用的研究進展[J].中草藥，2015，46（1）：128.

[2] Xiao J B， Capanoglu E， Jassbi A R， et al. Advance on the flavonoid C-glycosides and health benefits[J]. Crit Rev Food Sci Nutr， 2015， 56 （Supp 1）：S29.

[3] Lin C N， Kuo S H， Chung M I. A new flavone C-glycoside and antiplatelet and vasorelaxing flavones from gentiana arisanensis[J]. J Nat Prod，1997， 60：851.

[4] 徐浩，張力，高釗，等. 葛根素對大鼠心室肌細胞動作電位的影響[J]. 現代生物醫學進展，2014，14（19）：3635.

[5] Folador P， Cazarolli L H， Gazola A C， et al. Potential insulin secretagogue effects of isovitexin and swertisin isolated from Wilbrandia ebracteata roots in non-diabetic rats[J]. Fitoterapia，2010，81：1180

[6] Agnese A M， Pérez C， Cabrera J L. Adesmia aegiceras： antimicrobial activity and chemical study[J]. Phytomedicine，2001，8（5）： 389.

[7] de Oliveira D R， Zamberlam C R， Gaiardo R B， et al. Flavones from erythrina falcata are modulators of fearmemory[J]. BMC Complement Altern， 2014，5：288.

[8] Choo C Y， Sulong N Y， Man F， et al. Vitexin and isovitexin from the leaves of Ficus deltoidea with in vivo a-glucosidase inhibition[J]. J Ethnopharmacol， 2012，142：776.

[9] Lv H M， Yu Z X， Zheng Y W，et al. Isovitexin exerts anti-inflammatory and anti-oxidant activities on lipopolysaccharide-induced acute lung injury by inhibiting MAPK and NF-κB and activating HO-1/Nrf2 pathways[J]. Int J Biol Sci， 2016， 12（1）： 72.endprint

[10] Bramati L， Aquilano F， Pietta P. Unfermented rooibos tea： quantitative characterization of flavonoids by HPLC-UV and determination of the total antioxidant activity[J]. J Agric Food Chem，2003， 51：7472.

[11] 黃禮杰，陳耀旭，楊瑩瑩，等.改良的乳鼠心肌細胞分離與培養新方法[J].廣東藥學院學報，2015，31（3）：388.

[12] Xu H G， Jin T， Jie C，et al. Isolation of Ca2+ tolerant cardiomyocytes from aadult rats for patch clamp studies[J]. J Nanjing Med Univ，2004，18 （1）：4.

[13] 楊寶峰，蔡本志.心律失常發病機制研究進展[J].國際藥學研究，2010，37（2）：81.

[14] Zhang Y，Liu Y，Wang T，et a1.Resveratrol，a natural ingredinet of grape skin：antiarrhythmic efficacy and ionic mechanisms[J].Biochem Biophys Res Commun，2006，340（4）：1192.

[15] Michael G，Xiao L，Qi X Y，et a1.Remodelling of cardiac repolarization：how homeostatic responses can lead to arrhythmogenesis[J].Ear Soc Cardiol，2009，81： 491.

[16] 周婕，譚樹華，張善春.心肌細胞瞬時外向鉀電流與相關疾病的研究進展[J].中國心臟起搏與心電生理雜志，2012，26（3）：265.

[17] 蔡本志，潘振偉，楊寶峰.瞬時外向鉀電流與心臟疾病[J].心血管病學進展，2009（30）：50.

[18] 趙璐，蘇立.心房顫動與離子通道重構研究進展[J]. 心血管病學進展，2015，36（5）：580.

[19] 丁紹祥，任旭愛，王青，等. 對心臟“2相折返"發生機制再認識[J].醫學與哲學，2016，37 （10B）：54.

[20] 郭飛. 2相折返[J]. 臨床心電學雜志，2016，25（5）：397.

[21] Li Y X， Zhang Y Q， Yang T，et al. Pharmacokinetics and tissue distribution study of isovitexin in rats by HPLC-MS/MS[J]. J Chromatog B， 2015，991：1.

[責任編輯 張燕]endprint