一株粗糙脈胞菌的鑒定及產纖維素酶發酵工藝優化

張玲秀，白建華，郝瑞林，董社琴

（忻州師范學院生物系，山西忻州034000）

秸稈纖維素可再生、易獲得，其相對于木質材料木質素含量低，對其工業利用中酶需求量和花費也較低，所以玉米秸桿作為一種優質生物能源材料，更具有商業利用價值（Banerjee等，2008）。

通過微生物產酶降解秸桿纖維素具有條件溫和，無污染等優點，因此分離和篩選出針對不同行業的高效纖維素分解菌群，有望解決纖維素酶產量和活性不高，而成本偏高的問題 （張傳富等，2007）。 粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）是木質纖維素天然降解真菌，具有良好的遺傳操作手段和功能基因組工具，在纖維素降解、糖轉運及全糖利用、纖維素酶表達分泌的分子基礎等方面取得了顯著進展（Jonathan 等，2010；Tian 等，2009）。 李建波等（2004）對粗糙脈孢菌乙醇發酵、黑色素分泌、木糖發酵等做了較為系統的研究。馮炘等（2005）通過優化設計確定了Neurospora crassa 1602菌株搖瓶發酵的最佳產酶單因素產酶條件。顧芮萌等（2012）以粗糙脈孢菌基因組測序菌株fgsc2489為對象，利用相應面法，對粗糙脈孢菌纖維素酶液體發酵培養基進行了優化。

目前，對粗糙脈胞菌產纖維素酶液體發酵培養條件工藝研究鮮有報道。本文以從忻州農田玉米秸桿中篩選的一株粗糙脈孢菌為對象，以玉米秸桿粉為碳源，首先進行單因素優化，進一步利用響應面法，對粗糙脈孢菌纖維素酶液體發酵工藝進行優化。旨在提高產纖維素酶量，為其進一步開發利用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 斜面培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA），自然pH。產纖維素酶培養基/L：玉米秸桿粉2%， 蛋白胨 5.0 g，NaCl 0.5 g，KH2PO40.1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g， 酵母粉 1 g，pH 自然。1.2 方法

1.2.1 菌種的鑒定 菌種的形態學分類鑒定參見魏景超（1979）方法。

真菌18SrDNA擴增鑒定：采用CTAB法提取總 DNA，PCR 擴增引物為 ITS1：5'TCCG TAGG TGAA CCTG CGG3'和 ITS4：5'TCCT CCGC TTAT TGATATGC3'。PCR反應條件為94℃預變性4min，然后進入循環，94℃變性1 min，55℃退火40 s，72℃延伸 90 s，共 35個循環，最后 72℃延伸10 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離，Image Lab 3.0軟件分析。

1.2.2 CMC-Na酶活力測定 纖維素酶活力的定義（IU/mL）：指 1 min 催化底物生成 1 μmol葡萄糖所需要的酶量。

Y=（D·n·1000）/T·V·M；

式中：D為生成的葡萄糖含量；由標準曲線得知，n為稀釋倍數；T為反應時間，30 min；V為酶液體積，1 mL；M為葡萄糖的質量分數，180。

取兩支試管（試驗組和對照組），各加入2 mL 1%CMC-Na溶液，試驗組加 0.5 mL稀釋酶液，空白對照不加，混勻后置于50℃水浴，反應30 min，兩試管都加入DNS試劑3 mL，空白管加入100℃煮沸10 min后失活的酶液0.5 mL，搖勻后將兩管放入沸水浴加熱10 min，取出迅速冷卻到室溫，空白管調零，在540 nm下測試驗組吸光值，通過葡萄糖標準曲線計算還原性糖含量。

1.2.3 單因素及響應面法優化設計 單因素優化選取4個因素:培養時間、培養溫度、轉速、初始pH，以CMC-Na酶活力為指標，得到各因素最適水平，然后根據Box-Behnken設計原理，設計響應曲面分析試驗，其因素水平編碼見表1。

表1 因素水平編碼

2 結果

2.1 rDNA-ITS序列測序與比對結果分析 基因擴增產物純化后由生工生物工程（上海）股份有限公司測序，菌種與從GENBANK獲取的相似序列經DNAMAN軟件進行比對分析并構建N-J系統發育樹，如圖1。

圖1 粗糙脈孢菌QF的rDNA-ITS系統發育樹

2.2 培養時間對產酶量的影響 將活化菌種接入培養瓶中，28℃連續培養7 d，每隔24 h檢測一次酶產量，繪制產酶曲線。結果見圖2，第5天產酶量最多，因而后續研究選擇產酶最高的第5天進行分析。

圖2 培養時間對產酶的影響

2.3 培養溫度對產酶量的影響 分別選取不同溫度:22、25、28、31、34 ℃，連續培養 5 d 后，測定其酶活，結果見圖3，發酵溫度與產酶量有一定的關系，溫度過高或者過低都會影響酶的合成和分泌，其中，28℃條件下，產酶最高，為7.4 IU/mL。

圖3 培養溫度對產酶的影響

2.4 搖瓶轉速對產酶量的影響 在不同搖床轉速下（50、100、150、200、250 r/min）培養 5 d，測定其發酵液酶活，結果見圖4。

圖4 搖瓶轉速對產酶的影響

2.5 初始pH對產酶量的影響 不同初始pH培養基（1、3、5、7、9）對產酶量的影響如圖 5 所示。

圖5 初始pH對產酶的影響

2.6 響應曲面試驗結果

2.6.1 Box-Behnken設計試驗結果 以初始pH（X1）、轉速（X2）、溫度（X3）為自變量，以產纖維素酶量為響應指標，采用 Box-Behnken方法設計響應面分析試驗，試驗設計及試驗結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果

2.6.2 響應面設計結果 根據表2的試驗結果，利用Design Expert v8.0.5.b軟件對試驗數據進行分析，所得主要分析結果見表3。

二次模型中回歸系數的顯著性檢驗表明：因素A對產酶量影響效果的線性效應顯著，因素B和C效應不顯著；因素A2、B2、C2對結果的曲面效應顯著，因素交互影響均不顯著。對試驗數據進行多次擬合回歸，以纖維素酶量（Y）為因變量，初始pH（A）、轉速（B）、溫度（C）為自變量建立回歸方程模型為：

表3 回歸與方差分析結果

Y=+12.31+1.29A+0.88B+0.72C+0.41AB-0.068AC-0.022BC-2.23A2-3.47B2-1.89C2。

另外，由表3可知，試驗因素對產酶量影響顯著程度由大到小依次為初始pH＞轉速＞溫度；模型的回歸F值為11.91，P=0.0018（P＜0.05為模型顯著），表明該模型極顯著；多元相關系數R2=0.9387，調整R2=0.9399，表明模型對試驗實際情況擬合較好，失擬項差異不顯著 （P=0.2277＞0.05），表示該方程試驗擬合效果較好。

2.6.3 響應面圖及等高線圖 響應面和等高線結果見圖6～8。在響應曲面圖中，單因素影響效果與曲面陡峭相關，曲面越陡峭，影響越顯著。等高線圖與響應面圖相對應，響應值越大曲線越接近中心。各因素交互作用與等高線形狀相關，圓形則為不顯著，橢圓為顯著。

通過 Design Expert（v8.0.5.b）軟件分析，粗糙脈孢菌產酶量的最佳培養條件為初始pH 7、轉速159.24 r/min、培養溫度27.9℃，此條件下菌體生物量的理論值為17.67 IU/mL。在該條件下進行3次試驗驗證，產酶量平均值為17.1 IU/mL，與預測值的誤差僅為3.23%，表明該模型可靠性高，應用響應曲面法優化粗糙脈孢菌產纖維素酶的培養條件是可行的。

圖6 初始pH與轉速及其交互作用對產酶量影響的響應面和等高線圖

圖7 轉速與溫度及其交互作用對產酶量影響的響應面和等高線圖

圖8 初始pH與溫度及其交互作用對產酶量影響的響應面和等高線圖

3 討論

農業廢棄物主要包括農作物秸稈、畜禽糞便等，其主要組成成分是纖維素類物質?；ゎI域利用纖維素主要用高溫、高壓、強酸等方法處理，不僅成本高，而且污染環境（楊林麗等，2013）。

纖維素酶降解方法的優點是能源消耗低，是專一性很強的催化劑，但酶分子體積龐大，很難越過半纖維素和木質素的障礙，與纖維素緊密結合，所以進行該方法的反應時間長，且需在加熱過程中進行振蕩加熱，使反應充分，一般要培養5～7 d，在培養菌絲的過程中容易有雜菌生長，需進行雜菌的處理。另外應用纖維素酶法處理秸稈纖維素條件溫和，但酶活力一直達不到應用于實踐的水平，而且價格昂貴。所以開發高產纖維素酶的菌種，利用酶固定化催化法是可行的辦法（Rizzatti等，2001）。

響應面法是一項綜合數學和統計學方法的優化技術。此方法可以對影響相關響應值的多個因素進行建模和分析，評估多個因素與響應值之間的關系，得到最優發酵培養基條件（Jatinder等，2006）。

響應面分析法在粗糙脈孢菌產纖維素酶培養條件的優化中取得了較為良好的效果，利用粗糙脈孢菌發酵產酶的研究還處在初期階段，要實現其產酶潛力，還需要大量的研究，特別是針對深層液體發酵條件的菌株遺傳改造工作和適合粗糙脈孢菌液體發酵條件優化值得深入研究（顧芮萌等，2012）。

4 結論

本試驗以忻州地區腐敗玉米秸桿、牛羊等食草動物糞便為原料，從中篩選出一株降解纖維素菌種，并確定其為粗糙脈孢菌（Neurosporacrassa）。通過對其液體發酵產纖維酶工藝進行優化，在最佳培養條件初始pH 7、轉速159.24 r/min、培養溫度27.9℃下，經試驗驗證，產酶量為17.1 IU/mL，提高了39.1%。

[1]畢于運，寇建平，土道龍.中國秸稈資源綜合利用技術[M].北京：中國農業科學技術出版社，2008.

[2]馮炘，王丹，辛麗霞.粗糙脈孢菌產纖維素酶發酵條件研究[J].食品科學，2005，26 （1）：67 ～ 70.

[3]顧芮萌，李勇昊，田朝光.粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）纖維素酶液體發酵培養基的優化[J].中國生物工程雜志，2012，32（3）：76～82.

[4]李建波，宋欣，田敏，等.粗糙脈孢菌產黑色素條件優化及黑色素物理特性研究[J].山東大學學報（理學版），2004，39（4）：120 ～ 124.

[5]魏景超，真菌鑒定手冊[M].上海：上?？茖W技術出版社，1979（第一版）.

[6]楊林麗，杜雙田，許建周.纖維素降解菌篩選及混合菌種纖維素降解能力測定[P].西北農林科技大學，2013：1～5.

[7］張傳富，顧文杰，彭科峰，等.微生物纖維素酶的研究現狀[J].生物信息學，2007，5（1）：34 ～ 36.

[8]Banerjee G，Scott-Craig J，Walton J.Improving enzymes for biomass conversion:a basic research perspective[J].Bioenergy Res，2010，3：82 ～ 92.

[9]Fu D，Mazza G，Tamaki Y.Lignin Extraction from Straw by lonic liquids and Enzymatic Hydrolysis of the Cellulosic Residues[J].Agric Food Chem，2010，58：2915 ～ 2922.

[10]Jonathan M G，Tian C G，William T B，et al.Cellodextrin transport in Yeast for improved biofuel production[J].Science，2010，37（3）：128 ～ 132.

[11]Jatinder K，Chadha B S，Saini H S.Optimization of culture conditions for production of cellulases and xylanases by Scytalidium thermophilum using response surfacemethodology [J].World J Microb Bio，2006，22（2）：169 ～ 170.

[12]RizzattiAcS，Jorge J A，Terenzi H F，et al.Purificationand properties of a themostable extracellularβ-d-xylosidase produced by a thermotolerant spergillus phoenicis[J].J Ind Microbiol Biot，2001，26：156 ～ 160.

[13]Tian C G，William T B，Anthony T I，et al.Systems analysis of plantcellwalldegradation by the modelfilamentousfungus Neurospora crassa[J].Pnas，2009，330（6000）：84 ～ 86.