植物防御素基因家族結構、功能及調控研究進展

官麗莉 崔琪 李聲釗 董程 李海龍 彭建豪 李校堃

（1. 吉林農業大學生命科學學院，長春 130118；2. 吉林農業大學生物反應器與藥物開發教育部工程研究中心，長春 130118）

自然界幾乎所有生物群體體內中都含有防御素，而天然防御素是由自身進行長期的抗逆斗爭進化而來，并逐漸成為免疫系統必不可少的成分之一。植物防御素廣泛分布在植物的根、莖、葉、果實、塊莖和種子中，可抑制殺死多種病原真菌，因此可用來研制新型的殺菌劑或新型的抗生素類藥物。目前，在植物防御素的結構、功能和抗真菌機制等方面都已取得了較大的研究進展，但有關于植物防御素抗腫瘤、抑制酶活、作為離子阻斷劑等相關機制還值得更深入的研究。

1 植物防御素概述

1.1 植物防御素的發現與發展

1966年，Zeya等［1］首次于哺乳動物老鼠和豚鼠的多形核的嗜中性白細胞中發現了防御素，稱其為“溶酶體陽離子蛋白”。1985年，Robert等［2］首次對防御素進行了定義，即用來闡述存在于人體中的嗜中性白細胞內的一類抗惡性細胞和廣譜微生物的離子肽。1989年，法國學者Hoffmann等［3］對昆蟲進行研究，從中分離純化得到與兔子肺吞噬細胞防御素同源的昆蟲防御素。與哺乳動物和昆蟲防御素相比，植物防御素的發現相對較晚。1990年，Mendez等［4］首次從小麥、大麥種子中分離提純并得到具有防御作用的離子肽 r1-P和 r1-H。1995年，Terras等［5］從胡蘿卜種子中分離純化得到一個長度為5 kD新的富含半胱氨酸的抗真菌蛋白家族（Antifungal Proteins，AFPs），鑒于它們的高級結構與哺乳動物、昆蟲防御素類似，這種分子量較小的防御相關蛋白被正式命名為植物防御素。

最初研究表明，植物防御素只存在特定植物的種子中。但是經過十幾年的研究，科學家們證實了植物防御素存在于每個植物的不同器官和組織中。研究表明植物防御素在番茄［6］、結球白菜［7］、白色蕓豆［8］、甘藍型油菜［9］等植物生長發育、生理代謝中具有重要作用。

1.2 植物防御素的結構

目前為止，植物中提取的植物防御素有數百種之多，雖然不具有完全相同的的結構，但其大體結構基本相類似?？梢愿爬椋褐参锓烙厥且活愋⌒偷碾x子多肽，包含45-54個氨基酸殘基，含有半胱氨酸（Cys）穩定的αβ模序（Cysteine-stabilized alpha beta motif，Csαβ）［10］（圖 1），其中保守半胱氨酸殘基8個，且這8個半胱氨酸形成4對二硫鍵，其三維結構呈小球形，包括1個α-螺旋和3個β-折疊片層結構。其中含有的4 對二硫鍵連接方式分別為：Cys1-Cys8、Cys2-Cys5、Cys3-Cys6和Cys4-Cys7。

隨著研究進一步深入，逐漸從不同植物的花器官中發現有些植物防御素一級結構中不僅含有N端酸性信號肽，還含有額外結構域。例如，研究發現，發育中玉米籽粒防御素ZmESR6，含有額外的酸性C末端結構域。目前此附加結構域具體功能尚不清楚，但推測它在中和毒性蛋白中發揮重要作用。從最初擬南芥中提取的15種植物防御素中發現AtPDF3.1和AtPDF3.2的序列在信號肽和成熟防御素結構域之間含有富含酸性半胱氨酸的結構域，目前仍然需要確定此額外的結構域是否屬于前結構域，是否潛在地參與靶向或在蛋白質合成期間起到中和潛在的毒性堿性效應物的作用。

當然也存在一些特殊結構的植物防御素，林軍岳等［11］通過相關的預測軟件 I-TASSER發現，手掌參植物防御素Gcthionin的二硫鍵排布與其他植物防御素相比有其自身的特異性，除了Cys3與 Cys47，Cys14與 Cys34，Cys24與Cys43形成3對二硫鍵外，兩個游離巰基Cys20與Cys41未形成二硫鍵（圖 2）。

圖1 植物防御素的三級結構示意圖

1.3 植物防御素的分類

1.3.1 按結構分類 雖然植物防御素的基因序列具有較高的保守性，但是總的來說組成植物防御素的氨基酸平均保守性非常差，僅限于在11位置上的芳香族殘基、13位置的甘氨酸殘基、29位置的谷氨酸殘基。所以根據氨基酸保守性進行分類就顯得不是很現實。李鑫等［12］對115種植物防御素序列進行測序發現，氨基酸序列具有較高的同源性。因此根據成熟序列差異可將防御素分為兩大類，與擬南芥PDF1家族同源性較高的植物防御素被歸為第一類，與擬南芥PDF2家族同源性較高的植物防御素被歸為第二類。據研究，其中絕大多數植物防御素屬于第二類。一些較特殊的被歸為第一類，包括番茄、耬斗花中的各一個基因與蒺藜苜蓿、油菜中的多個防御素基因。

圖2 Gcthionin與典型植物防御素二硫鍵排布的比對

1.3.2 按結構和功能結合分類 早在1998年Segura等［13］就根據植物防御素成熟序列的差異和抗真菌活性的不同，將其進行了分類。包括兩大類和4個亞族，其中每大類中都包含兩個亞族。因第一亞族和第二亞族具有較高同源性被歸為第一大類，第三亞族和第四亞有較高同源性族被歸為第二大類。第一亞族包括能致使大刀鐮刀菌屬（Fusarium culmorum）菌絲產生多分支且能誘導菌絲體體尖端膨大生長的植物防御素。第二亞族包含對菌絲多分枝生長無作用但能抑制大刀鐮刀菌屬菌體生長的植物防御素。第三亞族包含除了能抑制毛盤孢菌（Colletotrichum lagenarium）、大刀鐮刀菌屬等絲狀真菌生長外，還能抑制格蘭氏陰陽性細菌生長的植物防御素。第四亞族包含對病原體無抗真菌作用的植物防御素。

1.4 植物防御素的功能

1.4.1 抗菌作用 大部分植物防御素都具有抗真菌的作用，其抑制真菌的IC50范圍為0.1 μmol/L到6.2 μmol/L（但也取決于不同真菌種類和不同來源的植物防御素）［14］。例如，胡蘿卜種子植物防御素RsAFP2抑制稻瘟病菌的活性IC50僅為0.1 μmol/L就可以達到良好的效果（表1）。當然也有一部分具有抗細菌的作用但是并沒有抗真菌那么強烈，其 IC50一般要達到100 μmol/L以上。

1.4.2 抗腫瘤作用 抑制腫瘤細胞增殖是植物防御素倍受人們關注的原因之一。已發現有多種植物防御素具有抗腫瘤作用，如田豆類植物防御素Sesquin對白血病細胞株L1210和M1細胞株的繁殖抑制率為80%［16］、風輪菜防御素對人Hela癌細胞株抑制率為80%［16］、利馬豆中防御素Limyin對人肝癌細胞株 Bel-7402 和人膠質細胞瘤 SHSY5Y 的 IC50濃度分別是 43 μmol/L 和 28 μmol/L［17］。

表1 植物防御素抗真菌活性IC50值（μmol/L）［15］

1.4.3 抑制酶的活性 有些植物防御素是酶活性的抑制劑，如大麥植物防御素能抑制蛋白質的翻譯過程；綠豆的防御素VrD1在昆蟲飼料中含量為0.2%時就能抑制昆蟲α-淀粉酶的活性導致昆蟲消化系統受損而死亡［18］；臘腸樹種子防御素5459具有抑制胰蛋白酶活性的作用［19］。

1.4.4 其他活性 植物防御素還有一些其他功能，如玉米種子防御素 γ1-zeathionin 和 γ2-zeathionin 可作為離子阻斷劑，能抑制哺乳動物細胞GH3的電壓門鈉離子通道，其抑制鈉離子電流的 IC50分別是62 μmol/L 和 33 μmol/L［20］；菜豆防御素 PvD1可抑制亞馬遜什曼原蟲的生長［21］；擬南芥防御素 AhPDF1.1可增強酵母對鋅的耐受性等。

2 植物防御素的抗菌機理

植物防御素可作為最直接的作用就是抗菌作用，到目前為止其抗真菌機理也較為清晰。關于抗菌機理主要有以下4種解說：（1）植物防御素與真菌特異性質膜組分相互作用（2）植物防御素被攝取并識別細胞內特異性受體（3）植物防御素活化下游信號傳導途徑（4）易感酵母的耐受機制和真菌物種對植物防御素活性影響［22-23］（圖 3）。

植物防御素可與真菌特異性質膜組分結合，導致病原菌細胞膜凹陷，嵌入細胞膜或轉運到細胞膜內，進而發生一系列的生物化學變化。即植物防御素與動物防御素和昆蟲防御素的抗菌機理不同，并非直接與病原體表面受體發生作用而使細胞膜的通透性改變，從而造成膜內外化學電勢差的改變來達到抗菌作用［24］。如10多年前，第一份研究報道植物防御素抗菌機制是其與真菌細胞膜上的復雜的含有鞘脂的肌醇磷酸（Inositol phosphoryl-containing sphingolipids，M（IP）2C）和葡糖苷（脂）酰鞘氨醇（Glucosylceramides，GlcCer）相結合，這些鞘脂不僅是真核細胞膜的重要組成成分，還作為第二信使調節細胞生存和死亡的微妙平衡。GlcCer不僅僅分布在真菌細胞膜上，也分布在真菌細胞壁中［25］，說明植物防御素也可以對細胞壁起殺傷作用。

對植物防御素殺死真菌的研究證明了GlcCer的重要作用，并證實的有5種不同的植物防御素，即煙草防御素 NaD1［26］、蘿卜防御素 RsAFP2［27］、蒺藜苜蓿防御素 MsDef1［28］、禾草防御素 Sd5［29］和豌豆 防 御 素 PsD1［30］。NaD1、RsAFP2、MsDef1、Sd5和PsD1都是與細胞壁上GlcCer相結合而發揮作用，不同的是MsDef1和sd5與之結合卻不被吸收，而RsAFP2、NaD1和PsD1被吸收到易感真菌的細胞質中發生一系列變化從而導致細胞質被破壞甚至細胞死亡［31］，如 Aerts等［32］報道，蘿卜防御素 RsAFP2與白念珠細胞GlcCer相互作用后，導致胞內活性氧ROS值升高，從而激活胞內胱天冬蛋白酶或半胱天冬蛋白酶來引起真菌細胞凋亡；芥菜防御素HsAFP1可導致胞內ROS值升高并直接誘導真菌凋亡；豌豆防御素PsD1可導致細胞周期的變化而誘導真菌凋亡（圖3-A）。

同時為了保護自己免受植物防御素的影響，病毒、易感酵母和真菌會有各種各樣的阻斷機制。如Hs AFP1耐受基因，就可牽連MAPK通路發揮關鍵作用，在不同的環境中維持細胞壁完整性的作用［33］。該誘導途徑在極化生長條件下（受到熱、低滲透壓、細胞壁損傷和氧化應激）才被激活［34］。同樣，蘿卜防御素RsAFP2和苜蓿防御素Ms Def1也會牽連真菌禾谷鐮刀菌發揮MAPK通路，從而保護病原體細胞壁的完整性［35］（圖 3-B）。

圖3 植物防御素抗真菌機制和真菌耐受機制［36］

3 外源表達植物防御素的研究進展

目前真菌病原菌侵染的植物物種逐漸威脅人類健康和破壞生物多樣性。受感染的主要是小麥、大豆、玉米和香蕉，導致了作物的產量下降，影響人們生活。因此，提高糧食安全和保護生物多樣性成為我們追求的目標。在過去十幾年中，我們發現轉基因超表達的防御素在幾種植物中明顯增加了對真菌疾病的抗性，這也表明它們在植物中具有抗真菌的潛力。從表2中可看出大多數研究是基于植物防御異源表達研究其對病菌的抑制作用。

表2 外源表達植物防御素的概述

4 結語

植物防御素廣泛的生物學功能具有無限的應用潛力，也必將對植物研究、生產、加工等諸多行業產生深遠影響。隨著對于植物防御素的研究的逐步加深、生物技術的不斷進步以及生物產業的深化與改進，植物防御素的價值將會越來越多的展現。

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