MicroRNA-21、microRNA-137和microRNA-498在肺腺癌患者血清中表達情況及其臨床意義*

唐曦，胡婭，徐炎華，汪春林，邱萍，王向輝

（1.華中科技大學同濟醫學院附屬荊州醫院 腫瘤中心，荊州 湖北 434020；2.長江大學醫學院，荊州 湖北 434023；3.華中科技大學同濟醫學院附屬荊州醫院 胸外科，荊州 湖北 434020）

肺癌的發病率居全世界所有惡性腫瘤的首位，年全球新增病例高達180萬，肺癌也是死亡率最高的惡性腫瘤，占所有惡性腫瘤死亡的30%左右[1]。近年來，肺腺癌在所有肺癌中所占的比例也逐步提高。目前應用于臨床的肺腺疾病診斷方法有多種，但真正較為成熟或有理想應用前景的診斷肺腺癌的手段并不多。

MicroRNA是一類內源性的非編碼RNA，由19～25個左右核苷酸組成，通過與靶mRNA的3’-UTR堿基互補配對，從而抑制mRNA翻譯或直接使其降解，導致靶基因的表達在轉錄后水平受到抑制，最終調控基因表達[2]。近年來的研究表明血清miRNAs表達譜與腫瘤的病理及臨 床特征都有關系，并且可以預測腫瘤的預后和指導臨床的處理。很多miRNAs在肺腺癌患者血清或癌組織中的異常表達可以影響腫瘤的行為和進展，其中包括miR-498、miR-21、miR-137、miR-206、miR-138、miR-32、miR-125b[3-8]。LI等[5]的研究發現miR-32在肺腺癌組織中表達增加，并可以通過下調TWIST從而影響肺腺癌的進展。CHEN等[8]的研究結果顯示miR-206靶向下調MET，抑制肺腺癌細胞的轉分化。但是目前為止這7種miRNA在患者血清中的表達及其在肺腺癌診斷中的應用價值尚未有報道。

在本研究擬通過檢測正常人群、肺腺癌患者血清 中 miR-498、miR-21、miR-137、miR-206、miR-138、miR-32、miR-125b這7種miRNA的表達情況，分析其在肺腺癌診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2010年4月-2016年4月華中科技大學同濟醫學院附屬荊州醫院腫瘤中心215例術前疑似肺癌患者及40例正常體檢人群靜脈血，血液采集后立即離心，血清保存于-80℃冰箱。所有患者術前均未行任何放、化療。入選者年齡37～83歲，平均（63.7±6.9）歲。最終術后病理診斷確認肺腺癌患者59例。本研究中患者均簽署知情同意書，并由華中科技大學同濟醫學院附屬荊州醫院倫理委員會審核通過。

1.2 方法

1.2.1 實驗試劑RNA提取試劑（美國Invitrogen公司），TaKaRa逆轉錄試劑盒（大連寶生物公司），SYBR Green熒光染料試劑盒（Roche公司），PCR引物由上海吉瑪公司設計合成。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測基因表達 提取所收集患者和體檢人群血清中總RNA，將提取的RNA進行逆轉錄合成cDNA，反應體系為20μl，反應條件為：16℃ 30 min，45℃ 30 min，85℃ 5 min。運用SYBR Green法檢測miR-498、miR-21、miR-137、miR-206、miR-138、miR-32 及 miR-125b的表達情況，運用的反應條件為：94℃ 15 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共循環 40 次 ；最后72℃延伸8 min。每組樣品重復3次，實驗重復3次，分析各標本中miR-498、miR-21、miR-137、miR-206、miR-138、miR-32及miR-125b的表達。

1.3 統計學方法

采用Medcalc和GraphPad Prism6.0軟件進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析，計數資料間比較用χ2檢驗，ROC曲線分析用于各miRNA對診斷肺腺癌的敏感性與特異性分析，采用多元Logistic回歸分析進行miR-498、miR-21、miR-137 3者聯合的ROC曲線分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺腺癌相關的miRNAs在兩組患者中的表達情況

肺腺癌患者血清中miR-21、miR-137和miR-498表達量與正常體檢人群比較，差異有統計學意義（P＜0.05），肺腺癌患者增加 ；miR-206、miR-138、miR-32、miR-125b的表達量兩組之間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。

表1 兩組患者血清中7種miRNAs的比較 （±s）

表1 兩組患者血清中7種miRNAs的比較 （±s）

組別 miR-498 miR-21 miR-137 miR-206 miR-138 miR-32 miR-125b正常體檢人群（n =40） 2.12±0.74 3.58±1.35 6.43±2.39 0.35±0.03 0.38±0.13 7.84±1.39 1.44±0.15肺腺癌患者（n =59） 2.84±0.90 5.90±1.95 8.29±2.88 0.35±0.11 0.41±0.22 8.17±1.32 1.51±0.17 F值 17.45 42.27 11.39 1.79 1.57 1.21 0.46 P值 0.000 0.000 0.001 0.174 0.243 0.313 0.501

2.2 miR-498、miR-21及miR-137在肺腺癌診斷中的ROC曲線分析

為了進一步評價血清miRNAs在肺腺癌診斷中的應用，本研究繼續對miR-498、miR-21及miR-137這3種兩組間表達有差異的miRNA做了ROC曲線分析。結果顯示miR-498的曲線下面積（area under curve，AUC）為0.73（95%CI，0.63～0.81），miR-21的 AUC為 0.83（95%CI，0.74～ 0.90），miR-137的AUC 為 0.74（95%CI，0.64 ～ 0.82）（見圖 1～3）。根據ROC曲線分析，本研究進一步確定miR-498、miR-21及miR-137用于診斷肺腺癌的最佳cut-off值，以及其在肺腺癌診斷中的敏感性和特異性（見表2）。對3種血清miRNAs肺腺癌診斷中做ROC曲線對比，結果顯示miR-498、miR-21及miR-137之間差異無統計學意義（P＞0.05）（見圖 4）。

圖1 miR-498的表達情況以及在肺腺癌診斷中的ROC曲線分析

圖2 miR-21的表達情況以及在肺腺癌診斷中的ROC曲線分析

圖3 miR-137的表達情況及在肺腺癌診斷中的ROC曲線分析

圖4 miR-498、miR-21及miR-137在肺腺癌診斷中的ROC曲線分析比較

2.3 miR-498、miR-21及miR-137 3者聯合在肺腺癌診斷中的ROC曲線分析

采用多元Logistic回歸分析得出用miR-498、miR-21及miR-137 3者聯合在肺腺癌診斷時其前的系數（miR-498、miR-21及miR-137）= -12.0668 +1.46085×miR-498+1.38797×miR-21+0.33292×miR-137。miR-498、miR-21及 miR-137 3者 聯 合在肺腺癌診斷中的ROC分析結果見表3。miR-498、miR-21及miR-137的AUC值大于單一檢測任一miRNA，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖5。

表2 ROC曲線分析比較

表3 miR-498、miR-21及miR-137在肺腺癌診斷中的ROC曲線分析

圖5 miR-498、miR-21及miR-137在肺腺癌診斷中的ROC曲線分析比較

3 討論

M iRNAs是一類進化上高度保守的非編碼小分子單鏈RNA，不僅可以游離于細胞之外，還能穩定的存在于血清中，研究表明血清miRNA耐RNA酶降解，煮沸、反復凍融、酸堿環境及長期保存等各種處理方法均不會造成血清miRNAs的損失，其具備作為疾病分子生物標志物的許多優點[9-10]。雖然血清miRNAs的來源尚無定論，但是miRNAs在不同疾病及病理進程中具有特定的表達譜，已經在多種腫瘤、自身免疫性疾病及炎癥等多種疾病的診斷和預后中顯示了獨特的價值。

本研究選取了目前在肺腺癌領域研究熱門的7種miRNAs， 包 括 miR-498、miR-21、miR-137、miR-206、miR-138、miR-32及miR-125b，檢測其在正常人群及肺腺癌患者血清中的表達情況，發現miR-498、miR-21及miR-137在肺腺癌患者血清中表達增加。MIMA等[11]的研究顯示，相比于正常結腸組織，在結腸癌組織中，miR-21表達增加，并與結腸癌的浸潤程度以及預后相關，之后他們進一步通過用miR-21干預結腸癌細胞，發現miR-21可以增加腫瘤細胞的增殖和侵襲[12]。同樣的，LEITE等[13]的研究發現在前列腺癌細胞中，miR-21通過控制RECK通路，從而增加前列腺癌細胞中MMP-9的表達，增加腫瘤細胞的侵襲能力。與本實驗的研究結果相符，JIANG等[7]的研究也發現肺腺癌患者血清中以及肺腺組織中miR-21的表達都升高，并在細胞實驗中進一步證實miR-21可以靶向結合缺氧誘導因子α，不僅可以作為肺腺癌診斷及療效評估的1個標志，而且還在肺腺癌的進展中發揮重要的調控作用。MiR-498是一種抑癌miRNAs，可調節多種與肺癌、結腸癌及宮頸癌等多種腫瘤的生長、侵襲和轉移調節有關的抑癌基因或蛋白，從而調控多種腫瘤的發生發展[14-17]。最近，WANG及其團隊的研究結果[14]發現miR-498在非肺小細胞肺癌中表達減少，而且miR-498的表達情況與腫瘤的侵襲程度呈負相關。

為了進一步評估miR-498、miR-21及miR-137在肺腺癌診斷中的臨床應用價值，本研究進一步對這3種miRNAs做ROC曲線分析，發現血清miR-498、miR-21及miR-137的表達情況在肺腺癌診斷中具有較高的AUC值，分別為0.73、0.83及0.74。之后筆者采用多元Logistic回歸分析得出用miR-498 & miR-21 & miR-137在肺腺癌診斷時其前的系數，對（miR-498 & miR-21 & miR-137）行ROC曲線分析發現其AUC值為0.93，優于單一使用任一miRNA來診斷肺腺癌。與筆者的研究結果相符，ZUO等[18]的研究發現在檢測AFP的基礎上，聯合檢測血清miR-125b和miR-27a的水平，可以大大提高早期肝癌患者診斷的敏感性和特異性。GU及其團隊的研究[19]也發現聯合檢測血清miR-182、miR-200c及miR-221的水平可以提到前列腺癌的檢出水平。隨著現在檢測技術和設備的提升，在少量的樣本中快速、靈敏的對miR-498、miR-21和miR-137同時進行檢測已成為可能[20]。miR-498、miR-21和miR-137聯合檢測可以大大提高肺腺癌診斷的敏感性和特異性，在肺腺癌的診斷中具有潛在的應用價值。

本研究存在不足之處，由于成本問題，本研究納入的樣本量相對較少，無法對大規模的樣本進行初步篩選，將在后續的研究中針對miR-498、miR-21和miR-137，釆取前瞻性研究的方法，進一步驗證其在肺腺癌診斷及預后中的價值。

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