血清1，25-（OH）2D3和MMP-9對哮喘患兒病情發生發展的影響

楊云，焦德清，周利

（1.四川省廣元市第三人民醫院 兒科，四川 廣元 628001；2.四川省廣元市中心醫院兒科，四川 廣元 628000；3. 四川省廣元市第四人民醫院 兒科，四川 廣元 6280 01）

哮喘是一種常見的慢性氣道炎癥性疾病，多個細胞及細胞組分參與其中，常表現為反復發作的喘息、胸悶、氣急或咳嗽等癥狀，氣道炎癥及呼吸道重塑是哮喘主要的病理生理機制。維生素D（Vitamin D，VD）是一種固醇類衍生物，1，25-二羥基維生素D3[1，25-dihydroxyvitamin D3，1，25-（OH）2D3]是其主要生物作用形式，可與受體結合發揮生物學效應，1，25-（OH）2D3除了可調節體內的鈣磷平衡，還能起 到影響呼吸道重塑、免疫調節、抗炎等多個功能，參與到哮喘的發病中?；|金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）屬于蛋白水解酶家族，主要調節體內細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的代謝，可降解大部分ECM，在該家族中，MMP-9是降解ECM的最主要的成員，而呼吸道重塑過程屬于ECM的重塑，故MMP-9在氣道重塑中同樣起到了重要作用。本研究分析哮喘患兒的血清1，25-（OH）2D3及血清、支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中MMP-9的水平，旨在探討兩者在哮喘的發病中的作用與意義?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月-2016年3月期間廣元市第三人民醫院收治的62例支氣管哮喘患兒為研究對象。納入標準：①符合2008年中華醫學會兒科學分會呼吸學組制定的兒童支氣管哮喘的診斷標準[1]；②處于緩解期，近1個月內未出現哮喘發作；③能配合完成纖支鏡檢查及支氣管肺泡灌洗術。排除標準：①近3個月服用鈣劑或維生素D片；②合并嚴重的肝、腎、心功能不全或甲狀腺疾病或骨質疏松；③近1個月內服用免疫調節劑或糖皮質激素。對所有哮喘患兒按照相關指南[1]進行嚴重程度分級，分為輕度組（n=17）和中重度組（n=45）。并選取同期因呼吸道異物或先天畸形住院的30例患兒作為對照組，均無免疫系統疾病或過敏性疾病或肝腎功能不全，近1個月均未出現感染。觀察組患兒男41例，女21例，平均年齡（5.52±3.12）歲，平均體重（14.25±8.31）kg；對照組患兒男23例，女7例，平均年齡（4.83±3.29）歲，平均體重（12.93±8.51）kg。兩組的性別、年齡、體質量等基線資料比較，差異無統計學意義。所有患兒及其家屬均自愿參加本研究，已簽署知情同意書，本研究已通過該院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 血清與BALF的采集 所有患兒均采集5 ml靜脈血，靜置2 h后離心（2 000 r/min×15 min），留取血清，-80℃待測。觀察組患兒在進行纖支鏡檢查后行右側肺葉的支氣管肺泡灌洗術，對照組患兒僅進行右肺中葉或非異物側肺葉的支氣管肺泡灌洗術，具體方法為：通過支氣管鏡吸引孔注入無菌鹽水（9 g/L、37℃），灌洗2次，若體重≥20 kg，則每次灌洗量為10 ml；若體重＜ 20 kg，則每次灌洗量為5 ml，灌洗后均立即以100～150 mmHg進行負壓吸引。

1.2.2 血清與BALF的檢測 將第1次BALF進行病原學檢查，第2次BALF進行離心（1 500 r/min×10 min、4℃），取上清液置于-80℃保存待測。采用酶聯免疫吸附法測定所有患兒的血清1，25-（OH）2D3水平，以及血清、BALF的MMP-9水平。并根據血清1，25-（OH）2D3水平將所有哮喘患兒分為VD正常組（＞30μg/L，n=9）、VD不足組（20～30μg/L，n=15）及 VD 缺乏組（＜20μg/L，n=38）。

1.3 統計學方法

采用SPSS19.0統計學軟件進行數據分析，計數資料采用χ2檢驗。計量資料首先進行正態性檢驗，若呈正態分布，則以均數±標準差（±s）表示，兩組比較用t檢驗，多組比較用方差分析，然后用SNK q檢驗進行兩兩比較，否則以中位數及四分位數間距表示，用非參數檢驗。采用Pearson相關分析來探討哮喘患兒血清1，25-（OH）2D3水平與血清、BALF的MMP-9水平的關系。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 觀察組與對照組患兒的血清及BALF的檢測結果比較

觀察組患兒的血清1，25-（OH）2D3水平與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），觀察組低于對照組。觀察組血清及BALF的MMP-9水平與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），觀察組高于對照組。見表1。

2.2 不同嚴重程度哮喘患兒血清及BALF的檢測結果比較

中重度組患兒的血清1，25-（OH）2D3水平與輕度組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），中重度組低于輕度組。血清及BALF的MMP-9水平與輕度組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），中重度組高于輕度組。見表2。

2.3 不同血清VD水平患者的血清與BALF的MMP-9水平比較

如表3所示，VD正常組的血清與BALF的MMP-9水平與另外兩組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），VD正常組低于另外兩組，VD不足組的血清與BALF的MMP-9水平與VD缺乏組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），VD不足組低于VD缺乏組。

表1 觀察組與對照組患兒的血清及BALF的檢測結果比較 （±s）

表1 觀察組與對照組患兒的血清及BALF的檢測結果比較 （±s）

組別 血清1，25-（OH）2D3水平 血清MMP-9水平 BALF的MMP-9水平觀察組（n =62） 20.13±6.57 138.63±25.79 8.29±1.67對照組（n =30） 40.16±6.92 58.06±11.27 5.58±0.92 t值 13.473 16.337 8.285 P值 0.000 0.000 0.000

表2 中重度組與輕度組的哮喘患兒血清及BALF的檢測結果比較 （±s）

表2 中重度組與輕度組的哮喘患兒血清及BALF的檢測結果比較 （±s）

組別 血清1，25-（OH）2D3水平 血清MMP-9水平 BALF的MMP-9水平輕度組（n =17） 27.16±4.13 101.66±16.89 9.56±0.85中重度組（n =45） 17.47±5.06 152.60±20.30 7.81±1.17 t值 7.045 9.199 5.619 P值 0.000 0.000 0.000

表3 不同血清VD水平患者的血清與BALF的MMP-9水平比較 （±s）

表3 不同血清VD水平患者的血清與BALF的MMP-9水平比較 （±s）

注：1）與VD正常組比較，P ＜0.05；2）與VD不足組比較，P ＜0.05.

血清MMP-9水平 BALF的MMP-9水平VD正常組（n =9） 101.15±8.50 5.87±1.09 VD不足組（n =15） 125.37±15.871） 7.66±1.011）VD 缺乏組（n =38） 152.74±20.691）2） 9.11±1.251）2）F值 45.893 40.269 P值 0.000 0.000組別

2.4 Pearson相關分析結果

結果表明，所有哮喘患兒的血清1，25-（OH）2D3水平與血清MMP-9水平呈負相關（r=-0.752，P=0.000），與BALF的MMP-9水平呈負相關（r=-0.698，P=0.000）。

3 討論

以往多個研究提示，血VD水平的缺乏與支氣管哮喘、活動性肺結核[2]、急性呼吸窘迫綜合征[3]、慢性阻塞性肺疾病[4]等多個呼吸系統疾病有關。本研究結果表明支氣管哮喘患兒的血清1，25-（OH）2D3水平低于支氣管畸形或異物者，并且中重度哮喘患兒的血清1，25-（OH）2D3水平低于輕度者，與國外以往研究[5]結果類似，提示哮喘患兒容易出現VD缺乏或不足，且哮喘嚴重程度與VD水平有關，提高VD水平可能有助于緩解哮喘發作癥狀。GUPTA等[6]研究表明絕大部分存在激素抵抗性的支氣管哮喘患兒存在血清VD水平降低的表現，且其水平與哮喘嚴重程度、第1秒用力呼氣量呈正相關，與呼出氣一氧化氮量、激素使用量呈負相關。TIAN等[7]研究表明對哮喘患兒補充1，25-（OH）2D3可減輕炎癥反應、降低氣道高反應性，影響呼吸道重構過程，從而有效緩解哮喘發作癥狀的嚴重程度，故1，25-（OH）2D3可應用于臨床。這可能與1，25-（OH）2D3對細胞因子的調節作用、血管重塑等有關。有動物研究[8]結果表明對哮喘大鼠模型給予1，25-（OH）2D3能降低血清IgE水平及BALF中嗜酸性粒細胞的量，促進白細胞介素10（IL-10）、轉化生長因子β（TGF-β）的分泌，抑制炎癥反應。MOLINARI等對人臍靜脈內皮細胞進行體外研究，發現VD不僅能與受體結合，通過對蛋白激酶B、細胞外信號調節激酶、p38等信號通路引起內皮型一氧化氮合酶的活化，引起血管重塑，還可直接誘導內皮細胞一氧化氮的生成，從而抑制血管平滑肌細胞的遷移與增殖，維持內皮細胞的完整性。GE等[9]研究表明與VD結合蛋白基因敲除的大鼠相比，野生型大鼠更容易出現肺微血管滲漏及出血，提示VD可能通過與VD結合蛋白結合進而影響肺的微血管內皮細胞。

本研究還發現觀察組患兒血清、BALF的MMP-9水平均高于對照組，且中重度組患兒的血清、BALF的MMP-9水平高于輕度組，提示MMP-9可能同樣參與了哮喘的發生發展過程中。ECM的沉積與降解失衡是哮喘氣道結構異常重建的重要原因，在這個過程中，MMP-9發揮了重要作用，其可降解多糖以外的大部分ECM成分?；|金屬蛋白酶組織抑制劑1（TIMP-1）是MMP-9的特異性抑制劑，在生理情況下TIMP-1與MMP-9以1︰1的比例結合，從而抑制MMP-9的活性。朱艷等[10]研究表明哮喘患兒急性發作期血MMP-9、TIMP-1及MMP-9/TIMP-1的比例均高于穩定期哮喘患兒及健康者，哮喘患兒的MMP-9表達強度大于TIMP-1，提示MMP-9與TIMP-1的失衡與呼吸道重塑有關，參與了哮喘的發病。值得注意的是，本研究發現哮喘患兒的血清1，25-（OH）2D3水平與血清、BALF的MMP-9水平均呈負相關，VD缺乏越嚴重，患兒的MMP-9表達水平越高，提示VD與MMP-9共同參與了哮喘的呼吸道重塑過程，提高VD水平可能抑制其重塑。BRITT等[11]對胎兒呼吸道平滑肌細胞加用1，25-（OH）2D3，結果顯示1，25-（OH）2D3可通過減少腫瘤壞死因子-α（TNF-α）來抑制MMP-9 的表達和活性，且1，25-（OH）2D3能通過減少TGF-β與TNF-α來抑制的Ⅲ型膠原纖維的表達，抑制呼吸道平滑肌細胞的增殖。LI等[12]研究顯示對大鼠給予VD缺乏的飲食并行卵巢切除術，發現此類大鼠的關節軟骨細胞分泌MMP-9與MMP-33的能力增強，相反，補充1，25-（OH）2D3則抑制MMP-9與MMP-33的表達。劉颯等[13]研究表明對支氣管哮喘患者而言，常規治療+VD治療組的血清IL-2、TNF-α水平低于常規治療組，且哮喘控制測試（ACT評分）顯示完全控制及部分控制患者比例高于常規治療組，提示補充血清VD可降低氣道反應性，提高哮喘的療效。

綜上所述，哮喘患兒的血清1，25-（OH）2D3水平下降，而血清及BALF的MMP-9水平升高，兩者共同參與了患兒的呼吸道炎癥反應和氣道重塑過程，提高VD水平可能有助于改善其病情。

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