Runx-2轉染骨髓間充質干細胞復合納米羥基磷灰石修復兔橈骨骨缺損效果觀察

李慶慶，廖福朋，桂先革，黃江鴻，王大平

大面積骨缺損可由創傷、腫瘤、感染及先天發育不良等所致，是骨科常見的疾病，也是治療的難題。目前的人工骨材料難以有效治療大面積的骨缺損。通過整合骨材料、成骨干細胞及成骨活性因子等提高人工骨材料的成骨活性是目前骨組織生物工程的研究重點[1]。骨髓間充質干細胞（BMSCs）作為種子細胞，在骨修復與重建中可分化為成骨細胞、骨細胞和軟骨細胞，促進骨愈合[2]。Runx-2在成骨分化的信號途徑中起核心作用，能誘導BMSCs向成骨細胞定向分化并成熟，從而促進骨愈合[3-4]；納米羥基磷灰石（nano HA）是目前應用廣泛的一種生物活性材料，具有良好的骨傳導性和生物相容性。本實驗利用重組Runx-2基因的慢病毒感染 BMSCs，將Runx-2BMSCs與nano HA共培養，并用于兔橈骨骨缺損模型，研究 Runx-2 BMSCs-nano HA成骨活性?，F報道如下。

1　資料與方法

1.1實驗動物及主要試劑、儀器Runx-2慢病毒表達質粒、nano HA人工骨由深圳市第二人民醫院組織工程實驗室制備提供；人胚腎細胞（293T細胞）、人非小細胞肺癌細胞（NCI-H1299）購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫；新西蘭大白兔由深圳市疾病預防控制中心提供；慢病毒包裝系統購于美國GeneCopoeia廣州復能基因有限公司；Anti-CD90/FITC，Anti-CD105/FITC，PCR試劑盒、番紅、蘇木精及快綠購于Sigma公司；DMEM-HG、MEM、LB液體培養基、RPMI-1640、雙抗、FBS、噻唑藍及二甲基亞砜購于GIBCO公司；CO2孵育箱(Thermo公司，美國)；倒置相差顯微鏡（Lecia公司，德國）、熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)；PCR擴增儀(Thermo公司，美國)；凝膠成像系統（Lifetech公司，美國）。

1.2方法

1.2.1Runx-2慢病毒的包裝、滴度檢驗將 Runx-2慢病毒載體質粒和包裝質粒共轉染293T細胞，進行Runx-2慢病毒的重組、擴增與純化。重組的慢病毒感染H1299細胞，計算出獲得病毒液的滴度（MOI），MOI=平均熒光數×細胞總數/實際添加的病毒液體積（ml），其中前期實驗中確定MOI值為50。

1.2.2兔BMSCs的分離、培養及鑒定將2個月齡新西蘭大白兔用10%水合氯醛腹腔麻醉，麻醉成功后備皮、消毒、鋪巾，用預混肝素的穿刺針在股骨中上段多點行骨髓穿刺。穿刺液用PBS液進行洗滌、離心，細胞懸液加入DMEM高糖培養基（含胎牛血清10%，雙抗1%）培養24 h后輕柔洗去懸浮細胞；48h后再次沖洗懸浮細胞。待細胞長滿培養皿底后用0.25%胰酶消化、傳代。鏡下觀察培養細胞的形態特征，并用流式細胞儀檢測BMSCs陽性表面標記物CD90和CD105。

1.2.3Runx-2慢病毒轉染兔BMSCs取 P3生長狀態良好，處于對數期的BMSCs細胞，制備細胞懸液，根據病毒滴度及MOI值準確計算病毒量。實驗組中加入4ml病毒液，對照組中加入4ml eGFP病毒液，空白組中加入4 ml培養液，培育48 h。

1.2.4Runx-2 BMSCs的鑒定 分別將Runx-2BMSCs，eGFP-BMSCs，BMSCs培育 1周，1周后行 RT-PCR，檢測Runx-2基因表達。

1.2.5兔橈骨骨缺損模型制備及植入實驗材料

1.2.5.1制備材料 將nano HA材料裁剪為13 mm×4 mm×4 mm 大小，反復75%乙醇溶液消毒、PBS沖洗后，將nona HA與BMSCs共培養24 h。取制備的Runx-2 BMSCs離心、重懸細胞，調整細胞濃度為1×105/ml，將細胞液種植于制備的 nona HA材料表面，使 Runx-2 BMSCs與nano HA充分復合，設為實驗組（A組）。同法制得eGFP-BMSCs-nano HA為B組，BMSCs-nano HA為C組。

1.2.5.2動物模型制作 取40只健康6個月齡新西蘭大白兔，隨機分為A組、B組、C組及空白組。予10%水合氯醛腹腔麻醉，麻醉成功后，常規備皮、消毒、鋪巾，橈骨中段做縱行切口，直至骨膜，用線鋸截骨制成約15 mm橈骨骨缺損模型，同時去除依附骨膜及周邊骨膜，并分別植入Runx-2 BMSCs-nano HA（A組），eGFP-BMSCs-nano HA（B 組），BMSCsnano HA（C組），空白組不植入材料，皮膚全層縫合，無菌敷貼覆蓋。分籠飼養，自由活動。觀察兔的狀態及傷口愈合情況。分別于術后4、8及12周分別對手術部位行X線檢查。術后12周空氣栓塞法處死實驗兔，完整取出橈骨標本，甲醛固定后制備病理切片，行HE染色觀察骨缺損恢復情況。

2　結果

2.1慢病毒滴度檢驗（熒光法） 熒光顯微鏡下，每孔隨機抽取10個視野范圍，數出熒光細胞數。測得Runx-2慢病毒滴度為4.8×109TU/ml，F組為空白對照組，熒光顯微鏡下未發現綠色熒光細胞（封三彩圖2）。

2.2兔BMSCs的鏡下形態 重懸浮后鏡下可見大量圓形懸浮細胞。24h培養后，部分細胞開始貼壁生長，仍有大量細胞懸浮生長，PBS液輕柔洗去懸浮細胞；72 h后貼壁細胞呈梭形、多角形，有偽足，呈集簇生長；P3細胞形態趨于穩定，可呈長梭形、紡錘形，細胞分布均勻，無集簇生長現象（封三彩圖3）。

2.3BMSCs流式細胞儀鑒定 取 P3 BMSCs進行細胞鑒定。選用BMSCs較特異的抗原CD90、CD105作為鑒定抗原。兩者抗原陽性率分別為 99.4%、99.2%，均超過 99%。鑒定結果符合BMSCs特征（封三彩圖4）。

2.4Runx-2BMSCs細胞Runx-2基因的表達 Runx-2慢病毒感染BMSCs1周，可見 Runx-2 BMCSs組 Runx-2表達較強，而eGFP-BMSCs及BMSCs組均未見明顯Runx-2基因表達（封三彩圖5）。

2.5實驗兔的形態 實驗兔術后 1周內活動減少，1周后逐步恢復活動能力，傷口輔料少許滲血，1周后拆線，未見實驗兔傷口感染、壞死，實驗兔死亡等情況。術后12周A組橈骨骨缺損已被正常骨所取代，表面連接平整，質地堅韌，未見軟組織長入；B、C組可見缺損部位骨材料已完全吸收，骨組織已連接兩端，但原缺損處有部分軟組織長入，未完全修復；空白組可見部分新生骨組織形成骨連接，大部分骨缺損處為軟組織替代，剔除軟組織可見愈合僅占橈骨1/3～1/2（封三彩圖6）。

2.6術后4、8及12周X線表現 A組術后4周 X線表現為復合材料出現吸收，材料與骨組織間無明顯間隙，過渡區呈高密度影，表明骨細胞在復合材料中礦化；8周時材料進一步降解，可見材料由外向內分解吸收，整個缺損區域出現高亮影，外側有骨橋連接；12周時復合材料已基本吸收，骨皮質連續，骨髓腔通暢，可見仍有部分骨痂存在。B、C組4周時可見材料部分吸收，材料與骨組織間出現間隙；8周時材料逐步降解，部分材料已被骨痂組織所取代，部分材料仍未出現礦化跡象；12周時仍有少量材料存在于骨組織間隙，骨皮質已連續，但骨痂較多，髓腔未通?？瞻捉M4周時未見斷端間組織鈣化；8周時斷端出現增生改變；12周斷端出現硬化跡象，部分皮質連續斷端軟組織未見鈣化形成（封三彩圖7）。

2.7病理觀察 A組：骨皮質、骨松質形成，分布較規整，其中可見大量成骨細胞及部分纖維細胞，可見骨髓組織，未見nona HA材料。B、C組：未見明顯nona HA材料，可見骨組織、結締組織及髓腔組織，其中骨組織量少而分布不規則，內可見多量成骨細胞，可見大量纖維結締組織?？瞻捉M：缺損區域以纖維結締組織為主，大量纖維細胞，未見骨組織長入（封三彩圖8）。

3　討論

Runx-2在成骨分化的信號途徑中被認為具有核心作用，能夠誘導BMSCs向成骨細胞定向分化，并促成骨細胞和軟骨細胞成熟，從而促進骨愈合[3-4]。在成骨分化的調節過程中，有多種活性因子直接參與成骨分化的調節，包括 BMP-2、BMP-4、BMP-7，TGF-1、TGF-2及IGF1等，但這些上游信號因子均與Runx-2存在相互作用，他們通過不同的信號通路使Runx-2基因表達上調，或使Runx-2蛋白磷酸化，調節其活性和功能，進一步調節BMSCs的成骨分化。在本實驗的前期實驗中，已制備Runx-2慢病毒質粒，并驗證Runx-2重組慢病毒感染BMSCs可調高BMP-2、OCN、ALP、OPN及osteonectin等成骨活性因子的表達，說明Runx-2具有促進其成骨分化的能力[5]。

支架材料作為干細胞依附生長，并植入體內的介質顯得尤為重要[6]。在既往的實驗中，骨支架材料僅僅被作為工程骨提供結構支持，包括金屬、陶瓷、人工或天然的高分子材料及復合材料等。這些支架材料最大的問題，就是與種子細胞的相容性不佳，或是種子細胞難以依附在其表面；或是種子細胞不能在其間誘導血管長入；或是種子細胞不能在其間形成正常骨組織。本研究選用的支架材料為nano HA，是因為nano HA與人體骨骼的無機成分相同，具有相當好的生物相容性[7]。羥基磷灰石粗糙的表面使BMSCs能夠依附、增殖、遷移；納米級材料擴大了材料的有效表面積，能夠吸附更多的BMSCs；更多的孔徑可以使BMSCs誘導血管長入。同時在骨的愈合過程中，nano HA逐漸被吸收，吸收的材料釋放鈣質，進一步被成骨細胞所利用，促進成骨作用。在本實驗X片中可以看到成骨作用并非由外到內，而是內外同時出現成骨現象?？梢越忉尀樵隗w外nano HA與Runx-2 BMSCs共培養時已充分接種，同時大量的孔徑能夠使營養物質進入到nano HA內部，允許內部的BMSCs增殖、分化，并最終成骨[8]。

骨缺損模型的制作也是本研究的難點之一。在實際醫療環境中，需要大面積異體骨移植的患者往往骨缺損較大，軟組織條件較差。而在動物模型上難以完全模擬這一情況，因此需要適當增大缺損骨面積，去除利于骨愈合的軟組織[9]。本研究選用的是兔橈骨缺損模型，橈骨與尺骨相連，故術后無需內固定亦可正?；顒?，既簡化了手術步驟，也減少了手術風險，減少了實驗動物的損耗[10]。Bighamsadegh等[11]認為兔的橈骨缺損模型達到1～12mm較為合理，而本實驗中將缺損模型定為15 mm，考慮需適當加大缺損體積，避免自行愈合可能。同時，筆者在實驗過程去除缺損段骨膜及上下緣部分骨膜，模擬軟組織缺損情況[12]。在實驗結果中，空白組不能自行愈合骨缺損，說明骨缺損模型是合適的。

盡管nano HA有諸多好處，但強度低、脆性大及不耐疲勞等影響著其在臨床中的應用；而骨缺損的患者往往需要更長的臥床時間，更長的非負重時間，這在一定程度上減少了nano HA的劣勢。盡管如此，一種具有良好生物相容性，又具有高強度、可降解的骨材料生物支架是本實驗組后期所需要研究的。

參考文獻：

[1] 王呈,曾炳芳.骨移植替代材料在創傷骨科的應用[J].國際骨科學雜志,2012,33(1):37-38.

[2]Bo-Nian Lin,Shu Wen Whu,Chih-Hwa Chen,et al.Bone marrow mesenchymal stem cells,platelet-rich plasma and nanohydroxyapatite-type Icollagen beadswere integral partsof biomimetic bonesubstitutes for bone regeneration[J].Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine,2013,7(11):841-854.

[3]Carbonare LD,Innamorati G,Valenti MT.Transcription Factor Runx-2 and its Application to Bone Tissue Engineering[J].Stem Cell Reviews and Reports,2012,8(3):891-897.

[4] 李慶慶,黃江鴻,何關健,等.Runx-2及其在骨組織工程中的應用[J].國際骨科學雜志,2014,35(1):44-46.

[5] 李慶慶,王大平,熊建義,等.Runx-2重組慢病毒感染骨髓間充質干細胞并促進其成骨分化的研究[J].中國臨床解剖學雜志,2015,33(3):311-315.

[6] Webster TJ,Ergun C,Doremus RH,et al.Enhanced osteoclast-likecell functionson nanophaseceramics[J].Biomaterials,2001,22(11):1327-1333.

[7] Nishida J,Shimamura T.Methods of reconstruction for bone defect after tumor excision:areview of alternatives[J].Medical Science Monitor International Medical Journal of Experimental&Clinical Research,2008,14(8):107-113.

[8]Kaigler D,Wang Z,Horger K,etal.VEGF Scaffolds Enhance Angiogenesisand Bone Regeneration in Irradiated Osseous Defects[J].Journal of Bone&Mineral Research,2006,21(5):735-744.

[9]Kang SH,Chung YG,Oh IH,et al.Bone regeneration potential of allogeneic or autogeneic mesenchymal stem cells loaded onto cancellousbonegranulesin arabbit radial defect model[J].Cell and Tissue Research,2014,355(1):81-88.

[10]Rathbone CR,Guda T,Singleton BM,et al.Effect of cell-seeded hydroxyapatite scaffolds on rabbit radius bone regeneration[J].Journal of Biomedical Materials Research,2014,102(5):1458-1466.

[11]Bighamsadegh A,Karimi I,Shadkhast M,et al.Hydroxyapatite and demineralized calf fetal growthplateeffectsonbonehea-ling in rabbit model[J].Journal of Orthopaedics and Traumatology,2015,16(2):141-149.

[12]Zhang YD,Wang G,Sun Y,et al.Combination of platelet-rich plasma with degradablebioactiveborateglassfor segmental bone defect repair[J].Acta Orthopaedical Belgica,2011,77(1):110-115.