中藥太靈丹對STZ誘導糖尿病腎病大鼠腎臟保護作用的影響*

李敏州，武 忠，張瑞霞，高 巍，趙凱瑩

內蒙古自治區人民醫院中醫科，內蒙古 呼和浩特 010017

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是臨床常見而難治的糖尿病微血管并發癥，是導致終末期腎病的首位病因(約占35%)［1］。由于該病的發病機制尚未完全闡明，故無理想的防治藥物，因此探討DN的發病機制、研究有效的防治藥物，已成為該研究領域的熱點。近年來的研究發現，腎間質纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是各種腎臟疾病發展至終末期的必經階段，其病變程度更能體現腎功能的惡化程度［2-3］。腎小管上皮細胞轉分化(tubular epithelialmesenchymal transdifferentiation，TEMT)被認為是腎間質纖維化發生的重要機制［4］，故對TEMT進行干預治療可能成為防治DN的有效措施。本研究擬通過建立鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病腎病大鼠模型，采用中藥太靈丹治療，并與纈沙坦進行對照，觀察中藥太靈丹對糖尿病大鼠腎小管上皮細胞轉分化的影響，為臨床防治糖尿病腎病腎間質纖維化提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 動物 8周齡SPF級雄性Wistar大鼠70只，購自中國醫學科學院動物中心，實驗動物合格證號：SCXK(京)2009-0004。飼養于內蒙古醫科大學基礎醫學院動物實驗室，溫度控制在22℃左右，濕度60%，12小時明暗交替照明。

1.2 藥物與試劑 太靈丹，主要藥物組成：太子參，靈芝，丹參，牡丹皮，赤芍，桃仁，紅花，生黃芪，當歸，熟大黃，枳實，甘草等(由內蒙古自治區人民醫院制劑室制備)。纈沙坦膠囊(商品名代文，北京諾華制藥有限公司，批號：X1006)。尿素氮試劑盒(批號：C013-1)、血肌酐試劑盒(批號：C011-1)、尿蛋白定量測試盒(批號：C035-2)、糖化血紅蛋白測定試劑盒(批號：A056-1)、甘油三酯測定試劑盒(批號：A110-2)（以上藥物均購自南京建成生物工程研究所）。TGF-β1抗體(美國Abcam公司，批號：ab92486），E-cadherin抗體(美國 CST公司，批號：3195S），α-SMA 抗體(美國 Abcam公司，批號：ab32575)，生物素標記的羊抗兔IgG(美國Jackson公司，批號：111065003)及辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素(美國Jackson公司，批號：016030084)，DAB顯色液(北京華肽先鋒生物科技有限公司，批號：41207-1)。

1.3 儀器 WL9-ONETOUCH Ultra穩豪血糖儀(美國強生)；7160全自動生化分析儀(日本日立)；奔騰MMX多媒體微機(MIAS2000型圖像分析系統)；6500i光學顯微鏡(中國重光)。

1.4 方法

1.4.1 造模與分組 大鼠適應性喂養1周后按體質量隨機分成正常對照組10只，喂食普通飼料(12%脂肪，60%碳水化合物，28%蛋白質)。其余60只Wistar大鼠飼以高糖高脂飼料(58%脂肪，25.6%碳水化合物，16.4%蛋白質)，自由攝食、飲水，并腹腔注射STZ 30 mg/kg，72小時后測血糖和尿糖，血糖≥16.7 mmol/L，尿糖4＋以上者為模型成功，并按大鼠體質量隨機分為造模組、太靈丹低、中、高劑量組、纈沙坦組，每組12只。

1.4.2 給藥 太靈丹低、中、高劑量組分別以生藥 5、10、20 g/kg·d 灌胃，纈沙坦組按 10 mg/kg·d灌胃，1次/d，正常對照組和模型組大鼠給予等量去離子水灌胃。定期測體質量與血糖，連續14周。

1.5 觀察指標

1.5.1 生化檢測 處死前，大鼠禁食水24小時，剪尾用葡萄糖氧化酶法測定血糖水平；代謝籠收集大鼠24小時尿液，CBB法測定24小時尿蛋白定量；10%水合氯醛麻醉下腹主動脈取血致死，比色法檢測全血糖化血紅蛋白(HAb1c)；分離血清，用苦味酸法測定血肌酐(Scr)水平、二乙酰肟比色法測定血尿素氮(BUN)、單試劑GPO-PAP法測定甘油三酯(TG)水平。

1.5.2 腎臟病理檢查 大鼠處死后立即摘取左側腎臟，剝去包膜，10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，制成 2 μm 連續切片，經HE、PAS 和 Masson 染色后，在中國重光6500i光學顯微鏡下觀察腎組織的病理形態學改變。雙盲給予HE染色下腎間質損傷病變計分，小管間質損害的特征按Banff分級［5］進行0～3+半定量計分：無變化評0分；輕度改變評1分(病變范圍＜25%)；中度評2分(病變范圍26%～50%)；嚴重評3分(病變范圍＞50%)。記錄連續不重疊的15個200倍視野的數值，取其平均值來比較每例切片的腎小管間質區域病變的程度。

1.5.3 免疫組化 石蠟包埋的4 μm連續切片，按說明書步驟進行α-SMA、E-cadherin及TGF-β1染色，DAB顯色，脫水，透明封固。結果判斷：PBS替代一抗作為陰性對照組。以胞漿內出現棕黃色或黃色顆粒為陽性結果，表示有標記蛋白的表達。根據腎小管上皮細胞的染色范圍判斷陽性表達強度。IHC半定量結果評定：根據染色程度和范圍進行分析評定。每例切片200倍下觀察20個互補重疊腎間質視野，根據染色程度和著色范圍［6］進行分析評定。將每張切片的染色程度和范圍得分相乘即為其最后得分。分別由2名醫師雙盲進行積分，取其平均值。見表1。

表1 IHC著色程度及范圍評分標準

1.6 統計學方法 利用SPSS 13.0軟件進行統計學分析，計量資料以(χ±s)表示，采用單因素方差分析及LSD-t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體質量及血糖 正常對照組大鼠體質量、腎臟質量、空腹血糖及HAb1c均明顯低于模型組(P＜0.01或0.05)，太靈丹高、中、低劑量組及纈沙坦組以上指標亦低于模型組，但差異無統計學意義(P＞0.05)。模型組大鼠的相對腎重較正常對照組大鼠有所增加，但差異無統計學意義(P＞0.05)。見表2。

2.2 24小時尿蛋白定量及血生化水平 正常對照組大鼠24小時尿蛋白定量明顯低于模型組(P＜0.01)，各治療組尿蛋白定量均低于模型組，且太靈丹組各劑量與模型組24小時尿蛋白定量比較差異有統計學意義(P＜0.05)。對照組TG明顯低于模型組(P＜0.01)，太靈丹各劑量組及纈沙坦組的TG水平均較模型組有所下降，且差異有統計學意義(P＜0.05)。見表3。

表2 各組小鼠體質量及血糖的變化(χ±s)

表2 各組小鼠體質量及血糖的變化(χ±s)

注：＊與表示正常對照組比較，P＜0.01

組別 只數 體質量/g 體質量/腎質量(×10-3)空腹血糖/(mmol·L-1) HAb1c/%正常對照組 10 236.71±8.44 5.57±0.43 4.87±0.24 4.40±0.20模型組 12 279.88±16.06＊ 6.37±1.85 23.4±4.31＊ 12.6±0.98＊太靈丹中劑量組 12 236.84±17.39＊ 5.93±0.30 18.1±3.95＊ 11.5±2.57＊太靈丹低劑量組 12 241.99±18.30＊ 5.92±0.65 18.0±1.88＊ 12.0±0.98＊太靈丹高劑量組 12 238.48±16.64＊ 5.83±0.45 17.9±2.12＊ 11.8±1.63＊纈沙坦組 12 254.68±18.54＊ 5.52±0.53 19.2±3.02＊ 12.3±2.31＊

表3 各組大鼠24小時尿蛋白定量及血生化水平的變化(χ±s)

2.3 腎臟病理改變 正常對照組：腎小球、腎小管及腎間質結構清楚，腎小管上皮細胞呈方形，大小一致，排列整齊，基底膜完整，間質中未見炎癥細胞浸潤和纖維組織增生，腎間質損傷評分為0分；模型組：腎小球肥大，基底膜增厚，細胞外基質增多及腎小管上皮細胞大量萎縮、空泡變性，間質內炎性細胞浸潤，腎間質損傷評分為(2.78±0.33)分。而太靈丹各劑量組和纈沙坦組相似，間質內炎性細胞呈小灶性浸潤，少許上皮細胞腫脹，少部分腎小管輕度擴張，腎間質未見明顯纖維化，腎間質損傷評分分別為(2.34±0.31)分、(2.23±0.22)分，與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 E-cadherin、α-SMA 及 TGF-β1表達 E-cadherin：正常對照組小鼠腎小管上皮細胞有較強的不均勻棕黃色細顆粒表達，且明顯高于其余各組小鼠(P＜0.05)，與模型組相比，太靈丹各劑量組及纈沙坦組E-cadherin表達增加(P＜0.01)，但各組間差異無統計學意義(P＞0.05)。

α-SMA及TGF-β1：其余各組與正常對照組比較，小鼠腎小管上皮細胞中α-SMA及TGF-β1表達明顯增強(P＜0.01)，經太靈丹各劑量組及纈沙坦組，上訴指標的表達較模型組明顯減弱(P＜0.01)，但各組間差異無統計學意義(P＞0.05)，見表3。

表3 各組腎小管上皮細胞E-cadherin、α-SMA及TGF-β1的表達(χ±s)

3 討論

RIF受多種因素的影響，其中TEMT在腎間質纖維化中起到關鍵作用［7-8］。腎間質纖維化的一個重要機制就是肌成纖維細胞(Myof)增多與活化，Myof是間質中分泌合成Ⅳ型膠原(ColⅣ)、纖維連接蛋白(FN)、層黏連蛋白(LN)等細胞外基質(ECM)成分的主要細胞，而ECM的過度積聚是RIF發生的主要病理改變，在腎間質纖維化發生發展過程中起重要作用。近年研究發現，肌成纖維細胞除了由成纖維細胞活化而來，還有約36%的新增纖維細胞來源于腎小管上皮細胞轉分化［9］。正常的腎小管上皮細胞具有旺盛的代謝活性和潛在的生殖能力，并能分泌多種細胞因子，在糖尿病腎病狀態下，由于腎小管和尿液經常接觸，尿液中的尿糖、蛋白、細胞因子等有害物質可直接引起腎小管上皮細胞損傷、活化及表型轉化。EMT的發生包括4個關鍵步驟［10］：1)腎小管上皮細胞間黏附丟失，即E-cadherin減少；2)α-SMA的表達增多；3)腎小管基底膜的破壞；4)細胞的移動和浸潤增加。轉化生長因子β1(TGF-β1)是目前公認的最重要的促纖維化細胞因子，它通過刺激相關細胞產生 ECM，最終導致纖維化的發生［11］。TGF-β1誘導的EMT最早期改變就是抑制E-cadherin的表達，E-cadherin表達減少則上皮細胞細胞間的極性和完整性遭到破壞［12］。受損的腎小管上皮細胞又可以分泌TGF-β1，刺激腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞表型轉化，并獲得肌成纖維細胞的表型—α-SMA［13-14］。故 E-cadherin、α-SMA 及 TGF-β1被認為是反映腎小管上皮細胞轉分化和腎間質纖維化程度的重要指標。

本研究采用STZ誘導的Wistar糖尿病腎病大鼠作為模型，采用高糖高脂飼料配合低劑量腹腔注射STZ(30 mg/kg)的方法進行造模，模擬2型糖尿病患者的發病方式。該造模方法具有簡單易行、重復性好、接近2型糖尿病患者的發病原因等特點［15］。實驗表明，STZ誘導的糖尿病腎病大鼠體質量、血糖、糖化血紅蛋白、24小時尿蛋白定量均較正常對照組大鼠明顯升高，病理顯示腎小球肥大，基底膜增厚，細胞外基質增多及腎小管上皮細胞大量萎縮、空泡變性，間質內炎性細胞浸潤，故STZ誘導糖尿病大鼠具有糖尿病腎病間質纖維化的表現。太靈丹各劑量組及纈沙坦組，上述改變較模型組明顯減輕(P＜0.05)，但各組間差異無統計學意義。提示太靈丹具有較強的降糖、減少尿蛋白及保護腎功能的作用。此外，通過免疫組化檢測到STZ誘導的糖尿病腎病大鼠腎臟中E-cadherin表達減弱、TGF-β1及α-SMA表達增強，說明STZ誘導的糖尿病腎病大鼠腎臟內存在EMT過程。經太靈丹及纈沙坦處理后，上述改變較模型組明顯減輕(P＜0.05)，但各治療組之間各指標差異無統計學意義(P＞0.05)。說明太靈丹可增強腎小管上皮細胞E-cadherin的表達，減少TGF-β1及α-SMA的表達，減緩腎小管上皮細胞的轉分化過程，延緩腎間質纖維化的發展。

糖尿病屬于中醫學“消渴”范疇，目前認為其病機以陰虛為本、燥熱為標；后期則氣陰兩虛，陰陽俱衰；正氣不足，瘀血內生。但糖尿病腎病后期患者因蛋白丟失過多，以及瘀血形成，因此正虛及瘀血表現得較重，而屬于邪實的血熱表現得不突出。太靈丹藥物組成中太子參補中益氣，靈芝補氣安神；“一味丹參，功同四物”，丹參養血活血，不燥不熱，與牡丹皮、赤芍共用涼血活血；桃仁、紅花活血化瘀；生黃芪，當歸取當歸補血湯之義，補氣以生血；熟大黃、枳實行氣降氣使補而不滯，甘草補氣解毒，調和諸藥，諸藥合用共奏益氣養陰，涼血活血之功。臨床用于治療早期及臨床期糖尿病腎病，有明顯的減少尿蛋白、改善腎功能的作用，安全有效?，F代藥理學研究表明，太子參多糖可以提高血清超氧化物歧化酶水平，降低丙二醛含量，保護胰腺，降低血糖，還能降低甘油三酯和膽固醇［16］；靈芝能夠減少糖尿病腎病大鼠IGF-1在DN的表達，從而保護腎臟的作用［17］；黃芪具有降血糖、下調TGF-β1的表達，減輕腎臟病組織病理損害，修復腎組織結構的作用［18］；大黃可通過抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，抑制細胞因子及ECM的合成，起到抗腎間質纖維化的作用［19-20］。

本研究結果表明，太靈丹可能是通過減緩EMT的進展，從而保護STZ誘導糖尿病腎病大鼠腎臟功能和組織結構，延緩腎間質纖維化的發展，本研究為糖尿病腎病的治療提供新思路，為糖尿病腎病臨床防治用藥提供實驗依據。