指標正交試驗法優選雙桂祛寒顆粒揮發油提取工藝*

劉 寧，劉效栓，李喜香，李季文

1甘肅中醫藥大學藥學院，甘肅 蘭州 730000；2甘肅省中醫院藥學部

骨關節炎是患病率較高的慢性關節疾病，伴有不同程度的關節疼痛，功能障礙，以及由于關節軟骨的惡化及其他關節結構參與而導致的生活質量下降［1］。據估計，60歲以上的世界人口中約有十分之一的人有關節問題，大部分是骨關節炎造成的。作為最常見的肌肉骨骼疾病之一，骨關節炎是導致疼痛、殘疾和降低生活質量的主要原因。近年來，隨著人口老齡化加劇，骨關節炎預計將成為未來的一個主要的衛生保健問題，在60歲以上的人群中，癥狀性骨關節炎的患病率預計將在2030年達到30%［2］。盡管如此，西醫學的管理仍然主要是對癥治療(例如，對乙酰氨基酚，非甾體類抗炎藥和物理治療)，目前還沒有有效的藥理學策略來防止這種疾病的惡化［2-3］。與此同時，以中醫理論為指導的中成藥復方及以有效成分為主的天然藥物具有多環節、多層次、多靶點綜合作用的特點，其在改善生活量、緩解癥狀、降低致殘率等方面顯示出重要的臨床價值和獨特優勢。雙桂祛寒方以傳統湯劑形式在我院臨床使用多年，由當歸、肉桂、獨活等10味藥組成，具有溫腎祛寒止痛，逐風活血通絡的功效，主要用于治療風濕性、類風濕性關節炎，強直性脊柱炎，肩周炎，頸椎病等風寒濕痹，以傳統湯劑形式在我院臨床使用多年。由于傳統湯劑在臨床應用中有諸多不便，本實驗組對其劑型改革，制備為顆粒劑。因本方中當歸、肉桂、桂枝等5味藥材含有較多揮發油，并且有明顯的藥理作用，如當歸揮發油具有抗血小板凝聚、神經保護和鎮痛消炎等作用［4］；肉桂和桂枝中的桂皮醛有明顯的鎮靜、鎮痛作用［5］。本實驗采用水蒸氣蒸餾法制得揮發油，以揮發油得率和藁本內酯及桂皮醛含量為指標，應用正交試驗優選其提取工藝，然后對確定的最佳工藝進行驗證，為雙桂祛寒顆粒的研制提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(美國Waters公司2695型),717自動進樣器,2487雙通道紫外檢測器；FA1004電子分析天平(上海良平儀器儀表有限公司)；HWS-24電熱恒溫水浴鍋(上海齊欣科學儀器有限公司)、燒瓶、揮發油提取器、燒杯。

1.2 試藥及試劑 當歸、肉桂等10味藥材由甘肅省中醫院提供，經李喜香主任藥師鑒定為正品；藁本內酯對照品(批號4431-01-0)、桂皮醛對照品(批號110710-201720)，購自中國食品藥品檢定研究院；乙醚(分析純)，購自利安隆博華(天津)醫藥化學有限公司；甲醇(色譜純)，購自天津市科密歐化學試劑有限公司；無水硫酸鈉(分析純)購自天津市北方天醫化學試劑廠。

2 方法與結果

2.1 揮發油提取方法 按處方比例精密稱取肉桂、當歸等5味藥材，共48 g，置圓底燒瓶中，加水，浸泡，用水蒸氣蒸餾法提取，于揮發油提取器中收集芳香水。

2.2 揮發油得率測定 將已制得的芳香水用乙醚萃取至水層無色，合并乙醚液，無水硫酸鈉脫水，室溫揮散乙醚，稱重，計算揮發油得率。

2.3 含量測定方法

2.3.1 色譜條件 色譜柱：symmetryshield RPC18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測波長：327 nm(藁本內酯)，290nm(桂皮醛)；柱溫：常溫；進樣量20μL；流動相：甲醇 - 水(65:35)；流速：1.0 mL/min。

2.3.2.1 對照品溶液的制備 藁本內酯對照品適量，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，超聲至完全溶解，作為藁本內酯對照品溶液(0.8 mg/mL)；另取桂皮醛對照品適量，精密量取，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，作為桂皮醛對照品溶液(0.0 2mL/mL)；最后精密吸取桂皮醛對照品溶液0.5 mL和藁本內酯對照品溶液1 mL置10 mL量瓶，用甲醇定容，作為藁本內酯、桂皮醛混合對照品溶液(藁本內酯含量為0.08 mg/mL，桂皮醛含量為0.001 mL/mL)。

2.3.2.2 供試品溶液的制備 吸取已制得的揮發油樣品置于10mL容量瓶中，精密稱定，用甲醇溶解并定容，超聲(25KHz)處理30分鐘混勻后，放至室溫，微孔濾膜(0.22)濾過，取續濾液作為供試品溶液。2.3.2.3 陰性對照品溶液的制備 精密稱取不含藁本內酯及桂皮醛的藥材樣品，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.3.3 方法學考察

2.3.3.1 專屬性試驗 精密吸取藁本內酯、桂皮醛混合對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液各10 μL，按上述色譜條件，雙波長同時測定，1=290 nm，2=327 nm；同時得到兩個不同波長的色譜圖。結果表明陰性對照無干擾，見圖1。

A1 藁本內酯、桂皮醛混合對照品溶液（1表示290 nm)

A2 藁本內酯、桂皮醛混合對照品溶液（2表示327 nm)

圖1 桂皮醛和藁本內酯的HPLC

2.3.3.2 線性關系考察 分別精密吸取藁本內酯、桂皮醛混合對照品溶液 5、10、20、30、40 uL，依次注入高效液相色譜儀，按“2.3.1”項下色譜條件測定，以進樣量(X)為橫坐標，色譜峰面積積分值(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：藁本內酯回歸方程為：Y=2E+06X+123 102；R=0.999 1；桂皮醛回歸方程為：Y=8E+08X-96776；R=0.999 9；藁本內酯和桂皮醛含量在分別在0.4～3.2 μg和0.005～0.04 μL范圍內線性關系良好。

2.3.3.3 精密度試驗 分別精密吸取“2.3.2.1”項下藁本內酯、桂皮醛對照品溶液，連續進樣6次，桂皮醛和藁本內酯等色譜峰峰面積的RSD值分別為1.15%和1.03%，均小于1.5%，表明精密度良好。

2.3.3.4 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別在 0、2、4、8、12、24 h進行 HPLC 色譜分析。桂皮醛等色譜峰峰面積的RSD值分別為1.37%和1.32%，均小于1.5%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.3.3.5 重復性試驗 平行稱取同一條件下得到的揮發油，按“2.3.2.2”項下方法制備供試液，以“2.3.1”項下色譜條件進樣，重復進樣6次，桂皮醛等色譜峰峰面積的RSD分別為1.42%和1.39%均小于1.5%，表明重復性良好。

現代社會開展“非遺”的生態化保護離不開科技創新?！胺沁z”的生態化傳承保護要堅持與時俱進，與社會科技發展同步，要積極運用前沿的科學技術，維護“非遺”傳承保護的條件，解決傳承保護的短板，助推項目傳承人文化層級的提升。

2.3.3.6 加樣回收率測定 精密稱取已知桂皮醛(4.24 mL/g)和藁本內酯(143.76 mg/g)的揮發油約0.1 g,平行取6份，分別加入桂皮醛0.424 mL和藁本內酯14.37 mg,按照供試品溶液制備方法處理，進樣，計算加樣回收率，桂皮醛的平均回收率為99.15%，RSD值為1.57%；藁本內酯的平均回收率為99.13%，RSD值1.62%。

2.3.3.7 樣品含量測定 分別精密吸取9個供試品溶液各10 μL,注入高效液相色譜儀，按“2.3.1”項下色譜條件測定樣品中藁本內酯和桂皮醛的含量。

2.4 正交試驗設計

2.4.1 單因素試驗 以浸泡時間、加水量、提取時間3個因素作為單因素考察對象，分別選取5個水平，按照以上提取方法提取揮發油，考察上述因素對揮發油提取率的影響。

2.4.1.1 浸泡時間的考察 按處方比例稱取肉桂、桂枝、當歸等5味藥材，加12倍量水，分別浸泡 0、0.25、0.5、1、1.5 小時，水蒸氣蒸餾法提取揮發油提取液，按“2.2”項下方法計算揮發油得率；揮發油得率分別為 0.211、0.323、0.405、0.398、0.245，故選擇0.25、0.5、1小時做為浸泡時間的考察因素。

2.4.1.2 加水量的考察 按處方比例稱取肉桂、桂枝、當歸等 5 味藥材，分別加 6、8、10、12、14倍量水，浸泡0.5小時，水蒸氣蒸餾法提取揮發油。按“2.2”項下方法計算揮發油得率；揮發油得率分別為 0.314、0.423、0.462、0.387、0.410，由于14倍水相較于12倍水揮發油得率并沒有顯著提高，故選擇8、10、12倍做為加水量的考察因素。

2.4.1.3 提取時間的考察 按處方比例稱取肉桂、桂枝、當歸等5味藥材，加12倍量水，分別蒸餾提取 2、4、6、8、10 小時，收集揮發油提取液，按“2.2”項下方法計算揮發油得率；揮發油得率分別為 0.285、0.399、0.411、0.409、0.396。故選擇 4、6、8小時做為提取時間的考察因素。

2.4.2 正交試驗結果 根據單因素試驗結果，選擇浸泡時間(A)、加水量(B)、提取時間(C)、空白(D)為考察因素，選用L9(34)正交表，并根據每個因素的單因素考察結果選擇3個最佳單因素水平(見表1)設計正交試驗，按處方比例平行稱取9份當歸、肉桂、桂枝、獨活、細辛藥材，進行正交實驗設計，分別測定揮發油得率并對相關指標成分含量測定結果進行綜合考察。(綜合評分揮發油得率、藁本內酯含量、桂皮醛含量的權重系數分別為20、40、40；綜合評分=揮發油得率/最大揮發油得率×0.2×100+桂皮醛含量/最大桂皮醛含量×0.4×100+藁本內酯含量/最大藁本內酯含量×0.4×100)，因素水平表見表1，正交試驗結果見表2，方差分析結果見表3。

表1 因素水平表

表2 正交試驗表

表3 方差分析

從方差分析結果可以看出在所選水平因素范圍內，各因素對揮發油含量的影響為B＞C＞A，即加水量＞提取時間＞浸泡時間，所以加水量對揮發油提取工藝有顯著影響，其次是提取時間，浸泡時間幾乎無影響。但為了讓其有效成分能充分提取并結合實際生產情況，遂提取時間選中間值6小時，最終的結果為A1B3C2，即加12倍水(考慮到吸水量多加2倍水)，浸泡15分鐘，提取6小時(C為次要因素結合實際條件選擇6小時)。

2.5 驗證試驗 按處方比例擴大8倍稱取肉桂、桂枝、當歸等5味藥材(平行3份)，共384 g,加入12倍量的水，浸泡0.25小時，水蒸汽蒸餾提取6小時。收集揮發油，用乙醚萃取2次，合并乙醚萃取液，用無水硫酸鈉脫水，過濾，揮發至無乙醚味，計算揮發油得率，測定藁本內酯、桂皮醛含量，計算RSD值。見表4。

表4 驗證試驗結果

3 討論

雙桂祛寒顆粒是根據古方傳統用法(湯劑)基礎上改制而成的，結合處方中各味藥的組成及與骨性關節炎藥理作用相關的有效成分的物理特性和作用特點還有實際情況，將提取工藝分為揮發油提取和水溶性物質提?。?］，使各味藥中的有效成分能夠最大限度的提取，從而提高中藥利用率和臨床應用療效。

該實驗參考文獻方法［7-8］，采用多指標綜合加權評價正交試驗法，使揮發油提取得率和有效成分結合，綜合考察各因素及水平對雙桂祛寒顆粒提取工藝的影響，在揮發油提取工藝優選中，當歸、獨活中所含的藁本內酯及肉桂、桂枝中所含的桂皮醛為主要的揮發油成分［9-11］。因此，選擇其作為該工藝的評價指標，對藁本內酯和桂皮醛進行HPLC含量測定，色譜條件為等度洗脫，使用全波長掃描測定，由于其兩種成分吸收強度差異較大，最終確定雙波長測定各成分，通過多次預實驗后采用HPLC法對其成分的含量測定，最終所得兩者的峰形及分離度較好，陰性無干擾，方法可行。且驗證試驗結果表明優選的最佳提取工藝參數合理穩定，且重現性良好，可用于實際生產。