基于自然對流PCR與毛細管電泳技術的牙周病原菌檢測

王林燕 陶春先 山口佳則 李振慶

文章編號： 1005-5630（2018）06-0007-06

摘要： 細菌種類的快速識別在牙病防治中具有重要的應用價值。以牙周病原菌為研究對象，建立了DNA快速擴增的自然對流聚合酶鏈式反應（PCR）方法及毛細管電泳熒光光學檢測系統。研究表明，當毛細管有效長度為8 cm、電場強度為100 V/cm時，50 bp DNA ladder在篩分介質為0.5%HEC（羥乙基纖維素）（1 300 K）中的分離效果最佳。毛細管電泳結果表明，采用自然對流法可以在25 min內在圓柱腔體中實現牙周病原菌的快速PCR。

關鍵詞： 毛細管電泳系統; 聚合酶鏈式反應（PCR）; 自然對流

中圖分類號： O 657.7文獻標志碼： Adoi： 10.3969/j.issn.1005-5630.2018.06.002

引言

牙周病僅次于齲病，是危害人類牙齒健康的第二大口腔疾病，通常是由齦下菌斑引起的[1-3]。人口腔內的細菌附著在牙齒表面形成牙菌斑，當這些細菌及其產物進入牙齦，便會引起牙齦纖維溶解及炎癥，炎

癥導致牙槽骨吸收，隨之牙齒出現松動甚至脫落[4]。據世界衛生組織統計，90%～95%的老年人都患有不同程度的牙周病，這也是人牙齒過早脫落的主要原因。同時，研究表明，牙周病還與中風、冠心病、糖尿病等疾病有一定的關系。隨著我國進入老齡化社會，這一健康問題將日益突出，為此，及時發現早期牙周病癥，并對其加以控制和治療，對牙齒健康具有重要的意義。

研究表明，在一些破壞性牙周病及其傳播中，特異性病原菌的作用成為大家研究的焦點。在這些牙周病致病菌中，革蘭氏陰性桿菌如齒垢密螺旋體（treponema denticola，T.d）等被認為是與牙周病發病機理密切相關的細菌[5]。它們在牙周病患者的口腔中大量生存，而在健康者口腔中沒有發現或存在數量極少。為此，微生物檢測有助于實現牙周病的早期診斷。雖然目前有細菌培養、形態學觀察、熒光抗體法[6]等方法對細菌進行鑒定和檢測，但這些方法因費時、費力、缺乏準確性，使牙周病致病菌的檢驗在臨床應用上受到很大限制，難以推廣。因此，建立快速的菌種檢測方法對研究牙周病致病菌及牙周病預防和治療有非常重要的意義。

盡管現行的聚合酶鏈式反應[7-9]（polymerase chain reaction，PCR）方法效率相對較高，但是傳統的PCR熱循環儀受變溫效率的限制，DNA樣品擴增時間相對較長。為此，本文基于自然對流理論，在試建的便攜式自然對流PCR（natural convection PCR，NCPCR）系統中對齒垢密螺旋體實現了快速PCR，并采用毛細管電泳法[10-11]對其PCR產物實現了快速檢測。

1原理及方法

自然對流PCR[12-13]是在一個圓柱型腔體內進行的，腔體的上表面保持低溫（55 ℃），下表面保持高溫（97 ℃）。由于上下表面溫度差使得腔體內不同位置流體的密度分布不同，溫度高的流體密度小，溫度低的流體密度大，從而使得底部液體上升，腔內頂部液體下降，最終使得液體在腔體內形成對流循環。當腔體內注入含有DNA模板及引物的PCR反應液時，通過優化圓柱腔體的幾何尺寸，腔體反應液便可以攜帶DNA經PCR的不同溫區，最終實現DNA的自然對流PCR。

依據電泳的基本原理，實驗室自制了毛細管電泳熒光光學檢測系統，如圖1所示，其核心部件為石英毛細管（Polymicro Technologies，美國）、正置顯微鏡BX51（奧林巴斯，日本）、MODEL 610E高壓電源（Trek公司，美國）。 其工作原理如下：汞燈光源發出的光經 UMWIB3濾光片（奧林巴斯，日本）過濾后產生波長為494 nm的激發光;DNA與熒光染料SYBR Green I結合物在高壓電場下流經毛細管，當DNA經過毛細管窗口時，受入射光激發（494 nm），產生中心波長為521 nm的熒光;熒光經光電倍增管R928（濱松光子學株式會社，日本）收集，獲得DNA的電泳圖譜，經CCD收集，可獲取DNA在毛細管內的運動圖像。為降低電滲流，采用線性聚丙烯酰胺對毛細管內壁進行鍍膜處理，電泳過程是在25 ℃的恒溫暗室中完成。

2試劑配制

2.1PCR反應試劑配制

在研制的便攜式自然對流PCR系統中對齒垢密螺旋體T.d實施PCR反應。T.d引物為5′AAGGCGGTAGAGCCGCTCA3′和5′AGCCCGCGCTCA3′（生工生物工程（上海）股份有限公司），對應的PCR產物片段為283 bp（bp表示堿基對）。將3.5 μL 10×Fast Buffer I、2.7 μL dNTP Mixture、0.7 μL T.d DNA模板、0.7 μL引物、0.175 μL SpeedSTAR HS DNA Polymerase（寶日醫生物技術（北京）有限公司）、26.525 μL滅菌水混合于離心管內。

2.2電泳試劑配制

用電子天平稱取0.05 g的羥乙基纖維素（hydroxyethyl cellulose，HEC）（1 300 K），取9.95 mL 0.5×TBE（TrisborateEDTA，TBE）緩沖液，將HEC緩緩倒入0.5×TBE緩沖液中，之后將HEC溶液置于磁力攪拌器上攪拌一周。取99 μL的HEC溶液和1 μL的100×SYBR Green I 配置成篩分溶液，取2 μL的50 bp DNA ladder（北京索萊寶科技有限公司）和98 μL的水配置成1.8 ng/μL樣品溶液。

2.3PCR反應液稀釋

從自然對流圓柱腔體中取出35 μL PCR溶液，放置于離心管，再往離心管中加入35 μL的純凈水，將反應液稀釋50%。

3結果與討論

3.1篩分介質質量分數對DNA分離效率的影響

篩分介質的質量分數決定了高分子線團在溶液中的分布狀態。質量分數較低時，高分子線團之間相互分離，隨著篩分介質質量分數的增加，高分子線團之間相互交纏，分離DNA的能力也隨之增加。為此，研究了電場強度為100 V/cm時，HEC（1 300 K）篩分介質質量分數對小片段DNA（<500 bp）的分離能力。研究顯示：當HEC質量分數為0.2%時，盡管可以在6 min內分離出DNA，但相鄰DNA片段幾乎重疊在一起，分離度較低，見圖2（c）;當HEC質量分數為0.5%時，雖然分離時間有所增加，但是相鄰DNA之間分離度明顯提高，見圖2（b）;當HEC質量分數為0.8%時，分離時間與分離度變化較小，見圖2（a）。為此，本實驗以0.5%HEC為篩分介質分離DNA。

3.2電場強度對DNA分離效率的影響

由于DNA經磷酸基團水解后帶負電，當毛細管兩側施加電壓時，電場強度決定了DNA在電泳緩沖液中所受電場力的大小。電場力越大，DNA運動速度越快，分析時間越短;反之，電場力越小，DNA運動速度較慢，分析時間延長。為此，研究了其他電泳條件一定時，電場強度對毛細管電泳分離DNA 能力的影響。圖3顯示了DNA 樣品在80 V/cm、100 V/cm、120 V/cm電場強度下的分離結果：隨著電場強度的增加，DNA分析時間由11 min降低至7.5 min以內;當電場強度由100 V/cm升高至120 V/cm時，250 bp與300 bp DNA ladder之間分離度明顯降低，整個DNA樣品分析時間無明顯縮短。為此，采用100 V/cm電場強度分離DNA樣品。

3.3毛細管有效長度對DNA分離效率的影響

毛細管有效長度決定了DNA片段在毛細管中的實際遷移距離。毛細管有效長度越小，DNA在篩分介質中遷移距離越短，DNA分析時間越短。然而，若毛細管有效長度過小，DNA尚未分離便已運動至檢測窗口，會造成相鄰DNA片段間分離度過低。為此，研究了其他電泳條件一定時，毛細管有效長度對DNA分離結果的影響。圖4為毛細管總長度為15 cm、電場強度為100 V/cm時，50 bp DNA ladder在不同的毛細管有效長度時的分離結果。數據顯示：當毛細管有效長度從7 cm增加至9 cm時，電泳分離時間由6.7 min增加至8 min，相鄰DNA片段間分離度變化不明顯;當有效長度為8 cm時，分離效果最佳。

3.4毛細管電泳檢測自然對流PCR產物

將底面直徑為1.5 mm、高為15 mm的圓柱腔體作為自然對流PCR反應腔體，圓柱腔體由聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）材料制成。底面與上表面分別施加溫度97 ℃與55 ℃，PCR反應液在圓柱腔體內反應25 min后將牙周病原菌T.d PCR產物取出，稀釋至50%后實施電泳，在優化的電泳條件下采用毛細管電泳檢測其PCR產物。圖5為電場強度100 V/cm，毛細管有效長度為8 cm，50 bp DNA ladder與T.d PCR產物在0.5%HEC（1 300 K）中的分離結果。數據顯示，目標產物電泳峰位于250 bp與300 bp電泳峰之間，表明在DNA圓柱腔體中可以成功實現自然對流PCR。

4結語

建立了基于自然對流的PCR方法，搭建了共聚焦熒光毛細管電泳光學檢測系統。在該檢測系統中以50 bp DNA ladder為研究對象，研究了篩分介質質量分數、電場強度及有效毛細管長度對DNA分離效率的影響。在圓柱型腔體中對齒垢密螺旋體實施了PCR。毛細管電泳結果表明，采用自然對流方法可以在25 min內成功實現PCR，后續工作將會設計高通量自然對流PCR芯片。

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（編輯：劉鐵英）