核桃仁皮不同極性提取物的 體外抗氧化活性分析

蒲成偉,闞 歡,劉 云

(西南林業大學,云南昆明 650224)

核桃(JuglanssigillataL)又名胡桃、羌桃,為核桃科(Jugladaceac)核桃屬(Juglans)植物。核桃不僅含有大量的油脂與優質蛋白質,還富含多種礦物質、多糖、黃酮和多酚類物質,是一種重要的營養保健佳品。核桃仁皮是核桃仁表面的一層薄膜,約占整個核桃仁質量的10%[1],鮮核桃成乳白色,干核桃為褐色。核桃仁皮中存在大量苦味物質,極易影響產品的口感[2],因此常被當做廢棄物處理,不僅造成了極大的資源浪費,也給環境帶來很大壓力。國外許多研究已經證明,核桃仁中對人體有益的多酚類物質主要集中在種皮部分[3-6],且核桃的功效與多酚類物質有直接關系[7-9],例如抗氧化[10]、抗腫瘤[11]、抗病毒[12]、抑菌、降血糖、降血脂、保護心血管[13]、抗衰老、提高免疫力、保護大腦和神經系統等[14-17],因此對核桃仁皮中多酚的研究具有重大意義。

本文采用云南大理泡核桃仁皮為原料,以有機溶劑萃取法得到核桃仁皮不同極性提取物,分別采用清除DPPH自由基、OH自由基、ABTS自由基體系與鐵離子還原能力對核桃仁皮不同極性提取物進行體外抗氧化活性分析,旨在為核桃天然抗氧化劑的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

核桃仁皮 云南大理泡核桃；Folin-Ciocalteu試劑 上海源葉生物科技有限公司;l,l-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(純度≥98%) Sigma公司;2,2-聯氮-雙-(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)(純度≥98%)上海源葉生物科技有限公司;硫酸亞鐵、磷酸二氫鉀、十二水和磷酸氫二鈉等 均為分析純,廣東光華化學廠有限公司;沒食子酸、水楊酸、過氧化氫、過硫酸鉀、鐵氰化鉀、氯化鐵、三氯乙酸、抗壞血酸VC、無水乙醇等 均為分析純,天津市風船化學試劑科技有限公司。

101-2AB型電熱風鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;YB-2型高速多功能粉碎機 永康市速峰工貿有限公司;電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;HH-2型恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電氣有限公司;德國Sigma 3k15高速(冷凍)離心機 上海思高勒生物科技有限公司;UV2600紫外分光光度計 島津儀器(蘇州)有限公司;FD5-series凍干機 美國金西盟國際集團中國分公司;RE-52系列旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;SB25-12DTDS型超聲波清洗機 寧波新藝超聲設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 核桃仁皮粗提取的制備 核桃仁皮粗提物的提取參照文獻[18-19]并略作修改。將核桃仁皮于50 ℃烘干至恒重,粉碎后過60目篩。準確稱取250 g核桃仁皮粉末,在60 ℃條件下加入60%乙醇(料液的質量體積比為1∶6),于200 W下超聲波輔助提取50 min,過濾,收集濾液;濾渣按上述步驟反復提取2次,合并濾液。將濾液在50 ℃條件下旋轉蒸發,除去溶劑,定容至100 mL,即為核桃仁皮多酚粗提取物。

1.2.2 核桃仁皮不同極性相提取物的制備 將100 mL核桃仁皮粗提物,完全轉移至分液漏斗中,按體積比(1∶1)加入石油醚,搖勻,靜置至完全分層,放出下層水溶液,倒出上層石油醚層溶液,將水溶液用同樣方法連續萃取2次;將三次石油醚溶液合并,在50 ℃條件下減壓濃縮,得到核桃仁皮的石油醚相提取物。采取同樣方法將剩余水溶液依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取,即可分別得到核桃仁皮氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水相的粗提物。將不同極性粗提物存放于4 ℃冰箱備用。

1.2.3 核桃仁皮不同極性相溶液的配制 準確稱取不同極性相的粗提物樣品0.1 g,溶解定容至100 mL容量瓶中,作為母液備用。乙酸乙酯、正丁醇、水相以蒸餾水為溶劑,氯仿、石油醚相以95%乙醇為溶劑,于4 ℃下避光保存。

1.2.4 多酚含量的測定

1.2.4.1 沒食子酸標準曲線的繪制 沒食子酸標準曲線的制作參照文獻[20]并稍作修改。準確稱取0.1 g沒食子酸,以蒸餾水為溶劑配制濃度為1 mg/mL的母液,將母液分別稀釋成濃度為10、20、30、40、50、60 μg/mL的沒食子酸標準液備用。準確移取10、20、30、40、50、60 μg/mL的沒食子酸標準液1 mL,Folin-Ciocalteau試劑5 mL,充分混勻,反應5～8 min后加入4 mL 7.5%碳酸鈉溶液,搖勻,避光反應1 h,以蒸餾水調零,于765 nm 波長處測定標準液吸光度,重復3次。以吸光值為縱坐標,質量濃度為橫坐標,得沒食子酸濃度(μg/mL)與吸光度(A)的回歸方程。

1.2.4.2 核桃仁皮不同極性提取物中多酚含量的測定 移取“1.2.3”方法所配制的不同極性溶劑提取物母液1 mL,用蒸餾水稀釋至50 mL,其余按照“1.2.4.1”方法操作,測定體系在765 nm處吸光度,并根據沒食子酸標準曲線方程式計算不同極性提取物中多酚含量。

1.2.5 核桃仁皮不同極性相提取物抗氧化實驗

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力的測定 DPPH自由基清除能力的測定參照文獻[21]并稍作修改。將濃度為1 mg/mL的不同極性相母液,以95%乙醇稀釋為2、4、6、8、10、20 μg/mL的樣品液。移取2 mL DPPH-乙醇溶液,2 mL不同濃度樣品液于試管中,混合均勻后,在37 ℃條件下避光反應30 min,在517 nm處測定吸光值AX,并以蒸餾水或95%乙醇替代樣品測吸光度A0,平行3次取平均值。以VC作對照。

DPPH自由基清除率公式如下:

式中:A0-空白吸光度,AX-樣品吸光度。

1.2.5.2 OH自由基清除能力的測定 OH自由基清除能力的測定參照文獻[22-23]并稍作修改。將濃度為1 mg/mL的不同極性相母液,以95%乙醇稀釋為200、400、600、800、1000 μg/mL的樣品液,依次往試管中加入9 mmol/L乙醇-水楊酸2 mL、9 mmol/L FeSO42 mL、樣品液2 mL、8.8 mmol/L H2O22 mL,每加一種溶液立即搖勻,以蒸餾水調零,測定AX,以蒸餾水代替樣品測定AO,以無水乙醇代替乙醇-水楊酸測定AX0。平行3次取平均值,以VC做對照。

羥自由基清除率公式如下:

式中:A0-空白吸光度,AX-樣品吸光度,AX0-無水乙醇代替乙醇-水楊酸吸光度。

1.2.5.3 鐵離子還原能力的測定 鐵離子還原能力的測定參照文獻[24]并稍作修改。將濃度為1 mg/mL的不同極性相母液以95%乙醇稀釋為20、40、60、80、100 μg/mL的樣品液。先后移取pH6.6磷酸緩沖液2.5 mL、1%鐵氰化鉀2.5 mL、不同濃度的樣品液2.5 mL于離心管中混合均勻,于50 ℃水浴20 min后,再加入10% 三氯乙酸(TCA)溶液2.5 mL,混合后于4000 r/min離心5 min,取上清液2.5 mL,加入蒸餾水2.5 mL、0.1%三氯化鐵2.5 mL,靜置10 min,700 nm處測定吸光值,以95%乙醇代替樣品做參比溶液,平行3次取平均值,以VC作對照。

1.2.5.4 ABTS自由基清除能力的測定 ABTS自由基清除能力的測定參照文獻[24]并稍作修改。ABTS自由基反應貯備液的配制:取50 mL濃度為7 mmol/L的ABTS溶液與50 mL濃度為5.0 mmol/L的過硫酸鉀溶液混合,在室溫下置于暗處反應12～16 h,作為反應貯備液,在波長734 nm處,用70%乙醇將ABTS自由基反應貯備液稀釋至吸光值為0.70±0.02備用。將濃度為1 mg/mL的不同極性相母液用70%乙醇稀釋為20、40、60、80、100 μg/mL的樣品液,分別向試管中加入0.1 mL不同濃度樣品溶液,3.9 mL ABTS自由基反應貯備液,室溫下避光準確反應6 min,以70%乙醇調零,于波長734 nm處迅速測定吸光值As。同時以70%乙醇替代樣品液作空白,于波長734 nm處測定吸光值Ab,平行3次取平均值,以VC作對照。

ABTS自由基清除率公式如下:

式中:A0-空白吸光,AX-樣品吸光度。

1.3 數據統計分析

采用SPSS 22.0與Microsoft Excel 2007對實驗數據進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 核桃仁皮多酚含量的測定

2.1.1 沒食子酸標準曲線 沒食子酸標準曲線見圖1。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

2.1.2 核桃仁皮不同極性相提取物中多酚含量 由圖2可知,各極性相多酚含量由高到低依次是乙酸乙酯相(805.6 mg/g)、水相(229.19 mg/g)、正丁醇相(164.66 mg/g)、氯仿相(103.12 mg/g)、石油醚相(37.75 mg/g)。在四種不同極性的溶劑中,乙酸乙酯提取相中的多酚含量分別是正丁醇提取相的4.89倍,氯仿提取相的7.81倍,石油醚提取相的23.41倍,因此核桃仁皮多酚的提取效果與溶劑極性有密切關系,且根據相似相溶原理,核桃仁皮中多酚的極性與乙酸乙酯溶劑的極性相近,與石油醚溶劑極性相差較大。

圖2 不同極性溶劑提取物多酚含量Fig.2 Polyphenol content in extracts of different polar solvents

2.2 核桃仁皮不同極性相提取物抗氧化活性的分析

2.2.1 核桃仁皮不同極性提取物的DPPH自由基清除能力 DPPH自由基中由于存在多個吸電子的-NO2和苯環的大π鍵,所以氮自由基能穩定存在。DPPH自由基的無水乙醇溶液呈紫色,在517 nm波長處有最大吸收,吸光度與濃度呈線性關系。向反應體系中加入具有自由基清除效果的樣品時,就可以結合或替代DPPH自由基,從而使DPPH自由基數量減少,吸光度變小,溶液顏色變淺,借此可評價樣品清除DPPH自由基的能力。

如圖3所示,核桃仁皮不同極性多酚提取物均具有清除DPPH自由基能力,且在一定濃度范圍內DPPH自由基清除率隨各極性提取物質量濃度上升而增加,但當各極性提取物達到一定濃度后,對DPPH自由基的清除效果趨于平緩。以IC50為衡量指標,比較幾種不同極性提取物對DPPH自由基的清除率,半數清除率越低,表明該種物質對DPPH自由基的清除能力越強,反之越弱,則DPPH自由基清除能力大小分別為乙酸乙酯(IC50=5.004 μg/mL)>VC(IC50=5.99 μg/mL)>水(IC50=6.745 μg/mL)>正丁醇(IC50=9.596 μg/mL)>氯仿(IC50=23.681 μg/mL)>石油醚(IC50=48.316 μg/mL)。各極性相多酚提取物清除DPPH自由基的整體效果由強到弱分別是 乙酸乙酯相>正丁醇相>氯仿相>石油醚相。當VC濃度分別低于5.5與8.0 μg/mL時,對DPPH自由基的清除效果弱于水相與乙酸乙酯相提取物,但高于其他相提取物,當濃度超過8 μg/mL時,清除效果最好。當濃度達到20 μg/mL時,各極性相提取物以及VC的清除率分別是乙酸乙酯相72.79%、水相65.32%、正丁醇相60.75%、氯仿相43.19%、石油醚相36.47%、VC83.84%。

圖3 核桃仁皮不同極性提取物對DPPH自由基清除效果Fig.3 DPPH radical-scavenging activities of different polar extracts from walnut kernel pellicle

2.2.2 核桃仁皮不同極性提取物的OH自由基清除能力 利用Fenton反應體系產生OH自由基,OH自由基極易攻擊芳環化合物產生羥基化合物,當向反應體系加入水楊酸時,OH自由基與水楊酸會產生在510 nm處有特殊吸收的2,3-二羥基苯甲酸。如果向反應體系中加入具有清除OH自由基能力的樣品液時,就會減少反應體系中的OH自由基,從而使有色化合物的產量減少,因此采用固定時間反應法,以反應體系在510 nm處的吸光度來反映樣品液對OH自由基的清除效果。

由圖4可知,核桃仁皮不同極性多酚提取物均具有清除OH自由基能力,在200～1000 μg/mL的濃度范圍內,OH自由基清除率隨質量濃度增加而升高。四種極性相多酚提取物清除OH自由基的整體效果順序為正丁醇相>乙酸乙酯相>氯仿相>石油醚相。以IC50為衡量指標,各極性提取物清除OH自由基的能力分別是VC(IC50=190.02 μg/mL)>正丁醇相(IC50=393.578 μg/mL)>乙酸乙酯相(IC50=510.186 μg/mL)>水相(IC50=603.429 μg/mL)>氯仿相(IC50=627.003 μg/mL)>石油醚(IC50=840.315 μg/mL),其中氯仿相與水相的IC50相近。在200～1000 μg/mL范圍內氯仿相與水相內的抗氧化物質對OH自由基的清除能力相當,同等濃度下的石油醚相提取物的抗氧化物質對OH自由基的清除效果低于其他溶劑提取物,正丁醇相提取物在濃度超過400 μg/mL時,對OH自由基的清除效果明顯增加。當濃度達到1000 μg/mL時,VC、正丁醇相、乙酸乙酯相、水相、氯仿相、石油醚相提取物對OH自由基的清除率分別為99.49%、74.2%、72.31%、65.55%、56.75%、53.96%。

圖4 核桃仁皮不同極性提取物對OH自由基清除效果Fig.4 OH radical-scavenging activities of different polar extracts from walnut kernel pellicle

2.2.3 核桃仁皮不同極性提取物的鐵離子還原能力 樣品本身是一種抗氧化劑,能使鐵氰化鉀的三價鐵還原成二價鐵(亞鐵氰化鉀),二價鐵(亞鐵氰化鉀)進一步再和三氯化鐵反應生成在700 nm處有最大吸光度的普魯士藍(Fe4[Fe(CN)6]3),因此測定700 nm處吸光度的高低可以間接反映樣品還原能力的大小,吸光度越大,還原能力越強。

由圖5可知,不同極性提取物均具有一定的還原鐵離子的能力,且隨著濃度的增加,體系吸光值越大,基本成線性關系,各極性相提取物濃度越高,鐵離子還原力越強。在同等濃度下乙酸乙酯相提取物的鐵離子還原能力最高,其次為正丁醇相與氯仿相提取物,石油醚相提取物最低,且在整個濃度范圍VC對鐵離子的還原能力與乙酸乙酯相提取物的還原能力相近,正丁醇相、水相、氯仿相對鐵離子還原能力相近。當濃度達到100 μg/mL時,各抗氧化劑的吸光度分別為VC=0.913、乙酸乙酯相=0.821、正丁醇相=0.509、水相=0.443、氯仿相=0.406、石油醚相=0.142?？傮w鐵離子還原能力的大小順序依次為VC、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相、氯仿相、石油醚相,這與清除DPPH自由基能力的順序一致。

圖5 核桃仁皮不同極性提取物的鐵離子還原能力Fig.5 The iron ion reduction ability of different polar extracts from walnut kernel pellicle

2.2.4 核桃仁皮不同極性提取物的ABTS自由基清除能力 ABTS自由基與過硫酸鉀反應生成穩定的藍綠色陽離子自由基ABTS+·,向反應體系中加入樣品液,則樣品液中的抗氧化物質會與ABTS+·發生反應,而使反應體系褪色,通過測定反應體系在734 nm處吸光度來反映樣品液清除ABTS自由基的能力。

由圖6可知,不同極性溶劑提取物清除ABTS自由基的能力具有差異性,且隨各極性提取物質量濃度升高而升高,清除力由強到弱依次是乙酸乙酯相、VC、正丁醇相、水相、氯仿相、石油醚相,這與不同極性溶劑對核桃仁皮多酚提取效果有很大關系,乙酸乙酯相提取物清除ABTS自由基的能力稍高于VC,遠高于其他溶劑提取物,氯仿相與石油醚相提取物對ABTS自由基清除率相當。當對ABTS自由基清除率達到50%時,各極性提取物的IC50分別為VC=50.166 μg/mL、乙酸乙酯相=29.654 μg/mL、正丁醇相=62.719 μg/mL、水相=79.575 μg/mL、氯仿相=144.475 μg/mL、石油醚相=146.424 μg/mL。

圖6 核桃仁皮不同極性提取物對ABTS自由基清除效果Fig.6 ABTS radical-scavenging activities of different polar extracts from walnut kernel pellicle

3 結論

采用溶劑萃取法得到不同極性提取相中的多酚含量有較大差異,其提取多酚的能力依次為乙酸乙酯>正丁醇>氯仿>石油醚,表明核桃仁皮中強極性多酚含量高于弱極性多酚含量。

通過對不同極性提取物的體外抗氧化活性分析表明:不同極性提取物在不同反應體系中對自由基的清除能力有差別,這可能與不同極性溶劑提取物中起到抗氧化作用的物質的結構與性質有一定關系。其總體抗氧化能力乙酸乙酯提取物最強,其次為正丁醇、氯仿提取物,石油醚提取物最低。為了更加深入的研究核桃仁皮多酚的抗氧化活性,可將核桃仁皮多酚類物質的分離、純化與結構鑒定作為當前研究的重點,以便確定抗氧化的物質基礎與作用機理。

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