豚鼠耳蝸基底膜響應特性的實驗測試與分析

塔 娜, 張 景, 許立富, 周 雷, 黃新生, 饒柱石

(1. 上海交通大學 振動、沖擊、噪聲研究所機械系統與振動國家重點實驗室，上海 200240；2. 復旦大學 附屬中山醫院耳鼻咽喉科，上海 200032)

耳蝸是聽覺系統中的重要器官，其工作機制的探究對了解人耳聽覺系統至關重要。耳蝸位于內耳，由充滿淋巴液的螺旋型空腔組成，而基底膜是其最重要的感音元件[1]。耳廓收集到的外界聲波經外耳道、鼓膜和聽骨鏈將振動傳到內耳，耳蝸內的淋巴液會在基底膜兩側形成壓差從而誘發基底膜振動，基底膜刺激聽毛細胞產生神經沖動，再傳到大腦聽覺神經中樞實現聽覺。由于基底膜觸動聽毛細胞產生神經沖動，所以測試耳蝸基底膜的振動特性對探究耳蝸的聽覺機制和傳聲特性具有重要意義。

人耳系統聽覺機制機理復雜，自19世紀以來，國內外學者進行了大量實驗研究耳蝸基底膜的振動特性。1960年， Von Békésy最早通過實驗發現基底膜的振動是以行波形式傳播的。耳蝸內的淋巴液首先誘發基底膜底部振動，這種振動再以行波的形式傳到基底膜頂部。后來，Rhode等[2]利用穆斯堡爾方法測試了活體松鼠猴耳蝸基底膜的振動響應，并發現基底膜響應具有非線性壓縮特性。Nam等[3-4]在實驗和仿真的基礎上，也證明了耳蝸具有主動放大基底膜的振動位移的作用。隨著測試技術發展，近年來，激光多普勒測振技術廣泛應用于動物實驗測試，Nuttall等[5-7]紛紛借助激光多普勒測振儀對貓、鼠等動物耳蝸基底膜振動進行了測試。由于豚鼠耳與人耳結構類似，并且其耳蝸直接暴露在聽泡內，方便實驗測量，所以豚鼠耳蝸常被用作探究耳蝸聽覺機制的實驗對象。目前，有國外學者通過實驗測試了豚鼠耳蝸基底膜的穩態響應、主動放大作用以及各種理化因素對其工作機制的影響[8-13]。郭夢等[14-15]也測試過短純音激勵下基底膜的振動速度，并分析了直流電對耳蝸基底膜的振動影響。近年來也有學者選擇豚鼠用于評價人工中耳的聽力補償效果[16]。但是與國外比較，目前國內還是主要利用數值模型對耳蝸特性進行仿真研究[17-22]，有關純音激勵下基底膜的振動速度和振動位移測試實驗未見相關報道，所以有必要對耳蝸基底膜的響應特性進行實驗測量，這既有助于了解耳蝸基底膜聽覺響應，又可以為耳蝸的理論建模提供實驗依據和指導。

鑒于此，本文利用激光多普勒測振儀，測試了在純音激勵下豚鼠耳蝸基底膜振動的速度響應和位移響應，并分析了基底膜振動幅值和相位隨聲壓大小和頻率變化的振動特性。

1 材料與方法

1.1 動物準備

實驗共準備了28只純色豚鼠(體重300～500 g)，其中14只豚鼠用于離體耳蝸基底膜動態特性測試。實驗前首先檢查豚鼠耳的健康狀態，確保豚鼠均沒發生中耳病變。并且，由于在實驗過程中需要對豚鼠耳蝸壁開孔，所以測試前還必須再次檢查耳蝸結構的完整性，保證豚鼠耳蝸結構沒有被破壞，標本可以用于基底膜響應的實驗測試。

實驗時，首先采用戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射和地西泮(5 mg/kg)肌肉注射的方式對豚鼠進行麻醉。待麻醉起作用之后，予以斷頭，再去除聽泡上的肌肉組織，就可以看到白色的聽泡。解剖完聽泡，再在顯微鏡下選用直徑為0.6 mm的耳科電鉆對耳蝸壁進行開孔。開孔時，先慢慢地用電鉆將耳蝸壁磨薄，本次實驗耳蝸開孔位置靠近基底膜底端。當開孔位置處骨壁變透，顏色變深，說明骨壁已經很薄了。再選用寬1 mm的針狀刀片的尖端輕輕將耳蝸壁挑破，剔除骨片，完成耳蝸壁開孔。在開孔過程中，一定要謹慎操作，防止破壞耳蝸結構的完整性，與此同時，開孔過程中還需補充適量生理鹽水，并用濕紗布包裹標本，防止聽泡脫水變質。

1.2 標本與儀器安裝

實驗裝置及測試過程如圖1所示。其中，圖1(a)為振動測試原理圖，圖2(b)為包括豚鼠耳蝸標本在內的實驗實拍圖。為了方便實驗測量，本次實驗選用微位移平臺和顳骨夾對標本進行調節和固定。實驗時，首先固定微位移平臺，再將固定了豚鼠耳蝸標本的顳骨夾放置在微位移平臺上。在顯微鏡下，調整激光探頭、顳骨夾以及微位移平臺，可以準確地將激光探頭發射的激光對準測試的目標靶點。

實驗時，首先在外耳道距離耳膜2～3 mm位置處放入送聲器(ER2, Etymotic)和測聲器(ER7C, Etymotic), 并用海綿將其封閉。選用美國Tektronix公司生產的AFG 3022B信號發生器驅動送聲器，產生純音信號激勵耳膜；同時利用測聲器檢測鼓膜處的聲壓，可以反饋調節輸入聲壓的大小，保證測試時的輸入聲壓是指定大小。其中，實驗前對送聲器和測聲器均進行了校核。實驗選用多普勒激光測振儀對基底膜的振動進行測量，需在基底膜測試位置處添加反光微粒以增強反射光強度。為了減小反光微粒對基底膜振動特性的影響，實驗選擇直徑為10～30 um的反光微粒，并在顯微鏡下借助直徑為0.12 mm的鋼針蘸取少許反光微粒放到目標靶點。由于耳蝸壁開孔后常會滲出少量淋巴液，淋巴液的弧形液面增加了放置反光微粒的難度，所以需要在高分辨率的顯微鏡下多次嘗試才能成功。圖2(b)右下角虛線框內為耳蝸開孔后的局部放大圖，其中(1)為基底膜放置反光微粒后的圖像，(2)為激光探頭發出的激光對準基底膜測試位置后的圖像。測試時，激光探頭與多普勒測振儀連接，通過數據采集系統，將采集到的信號傳遞給動態信號分析儀進行數據分析。

圖1 振動測試實驗示意圖Fig.1 Schematic diagram of the vibration testing experiment.

1.3 基底膜振動測試

實驗時，選擇德國Ploytec公司生產的激光多普勒激光測振儀測試純音激勵下豚鼠耳蝸基底膜的響應特性。其中激光測振儀包括激光探頭(OFV 505)和控制器(OFV 5000)。激光探頭接收到的反射光經動態信號分析儀后，可以輸出基底膜測試位置的振動速度和振動位移。測試時，在軟件LMS Test.Lab中設置分析頻率為25.6 kHz，采樣時間為0.32 s。測試結果經多次平均后存儲，用于后續數據分析處理。

2 結果

2.1 基底膜振動速度響應

信號發生器輸出1V電壓到送聲器，實驗測試了純音激勵下基底膜的速度響應。圖2給出了1 kHz純音激勵下基底膜振動速度的時域曲線及頻譜圖。其中圖2(b)基底膜振動速度頻譜圖包括上下兩部分，上面是幅值譜，下面是相位譜。從基底膜振動速度的時域波形和頻譜圖可以看出，測試的結果含有少量噪聲，這是由于耳蝸壁開孔滲出了淋巴液，淋巴液的孤形液面產生了光的散射現象。

圖2 1 V電壓驅動送聲器基底膜振動速度響應Fig.2 Velocity response of the BM when ER-2 derived under 1 V.

改變輸入聲壓的頻率，分別測試了1 kHz, 4 kHz和10 kHz聲激勵下基底膜的速度響應，對應的速度幅值分別為1.47E-004 m/s，3.20E-004 m/s和1.12E-004 m/s?？梢钥闯?，在大小相同、頻率不同的聲壓激勵下，基底膜同一位置處的振動速度大小不同，說明基底膜振動具有頻率選擇特性。

2.2 基底膜振動位移響應

根據Ren[23]的方法將ER-2型送聲器的頻率范圍擴大到10～20 kHz，測試了在外耳道施加70 dB、80 dB、90 dB三種大小純音激勵下基底膜的振動位移。實驗準備了14只豚鼠，共28個聽泡。但由于解剖和測試易對耳蝸和基底膜造成破壞，所以僅7組實驗滿足要求?；啄さ恼駝游灰祈憫鐖D3～5所示。

圖3 70 dB純音激勵下基底膜振動位移響應Fig.3 BM displacement response under 70 dB SPL pure tone excitation.

圖4 80 dB純音激勵下基底膜振動位移響應Fig.4 BM displacement response under 80 dB SPL pure tone excitation.

圖5 90 dB純音激勵下基底膜振動位移響應Fig.5 BM displacement response under 90 dB SPL pure tone excitation.

觀察基底膜振動位移幅值響應曲線，從圖3(a)、圖4(a)和圖5(a)中可以看出：5 kHz范圍以內，基底膜振動位移幅值變化不大；從5 kHz到11 kHz，振動幅值逐漸增大，在11 kHz達到最大值；超過11 kHz，基底膜振動位移又迅速減小。對應70 dB、80 dB、90 dB三種聲激勵，基底膜振動最大位移分別為7.8 nm、25.16 nm和74.45 nm。觀察基底膜振動位移相頻曲線，從圖3(b)、圖4(b)和圖5(b)可以看出：三種聲壓激勵下基底膜相位不僅變化趨勢一致，而且數量大小也相差不大；10 kHz范圍以內，相位變化相對平坦；超過11 kHz之后，相位迅速下降，其中在11 kHz基底膜振動相較于外耳道輸入聲壓相位滯后大概530°左右，而到19 kHz時滯后相位達到了1 300°。

3 討 論

本次實驗的目標是探究純音激勵下豚鼠耳蝸基底膜的響應特性，所以維持基底膜的生理特性是實驗的關鍵，實驗過程中除在基底膜放置反光微粒以外，要求與基底膜沒有其他任何接觸。并且整個實驗操作都需認真細致，盡量減小實驗過程對基底膜的損傷。由于實驗過程中必須對耳蝸壁開孔，開孔操作稍有不慎就會損傷耳蝸結構，并且開孔過程中落到基底膜上的骨粉也會污染基底膜，所以實驗難度大，對實驗人員的要求高，本次實驗只有7組測試滿足測試要求。

本次實驗選用顳骨夾對耳蝸標本進行固定，比較牢固，并且由于顳骨夾下面是圓形的，方便角度調節，可以使得測試激光準確地對準基底膜的測試位置。測試時，選擇激光直接照射到基底膜上進行測量，與文獻[14]中在耳蝸孔上覆蓋玻片不同，這是由于透過玻璃片的反射激光強度較弱并且不穩定，但是直接測量時，滲出的淋巴液也會使光線散射而給實驗帶來誤差。

分析測試結果，從圖2(a)中可以看出純音激勵下，基底膜的振動速度是正弦信號。改變輸入聲壓的頻率，對比基底膜同一位置處的振動速度幅值，結果顯示基底膜在大小相同，頻率不同的純音激勵下振動速度大小不同，說明基底膜的振動具有頻率選擇特性。與此同時，從圖3～圖5基底膜振動位移響應曲線可以看出，基底膜的振動位移響應存在明顯的峰值，峰值對應的頻率稱為最佳頻率。對比70 dB、80 dB、90 dB三種聲激勵下耳蝸基底膜位移幅值響應，可以看出在不同強度的聲激勵下，基底膜均在11 kHz取得最大值，說明本次實驗基底膜測試位置的最佳頻率為11 kHz。觀察位移響應曲線，超過最佳頻率11 kHz之后，基底膜振動的位移響應迅速減小，斜率很大；而在低于最佳頻率的頻率范圍內，1 kHz到5 kHz的位移響應曲線很平坦，從5 kHz開始基底膜的位移響應才逐漸增大，曲線斜率也逐漸增加。這是典型的行波傳輸曲線。根據行波理論，鐙骨底板的振動首先會刺激靠近卵圓窗的基底膜振動，這種振動再以行波的形式從基底膜的底部傳播向頂部傳播。純音激勵時，基底膜的振動位移沿基底膜先逐漸增大，在最佳頻率位置處達到最大值，之后再迅速減小，形成行波包絡。并且低頻信號的包絡線比高頻信號的包絡線要寬，所以基底膜位移響應在低于最佳頻率范圍內增加緩慢，響應曲線斜率小，而在超過最佳頻率后響應曲線迅速降低，坡度大?；啄げ煌恢锰幍淖罴杨l率不同。越靠近基底膜頂部，最佳頻率越低；越接近基底膜底部，最佳頻率越高。另外位移響應曲線在14 kHz處出現了峰值，可能是由基底膜振動導致測試位置有所偏移造成的。

雖然本次實驗測量的是離體被動耳蝸，但是實驗結果對了解基底膜的動態特性和耳蝸的傳聲機理都具有非常大的參考價值。接下來的研究重點是探究活體動物實驗的測試方法，進一步了解基底膜的響應特性。

4 結 論

本次實驗研究了純音激勵下豚鼠耳蝸基底膜的響應特性，利用激光多普勒測振儀測試了離體豚鼠耳蝸在70 dB、80 dB和90 dB三種大小聲激勵下基底膜的振動速度和振動位移。實驗結果表明：

(1)純音激勵下，基底膜的振動速度是正弦信號。并且在大小相同、頻率不同的聲壓激勵下，基底膜同一位置處的振動速度和振動位移大小不同。

(2)基底膜具有頻率選擇特性，并且基底膜上的振動以行波的形式傳播。

(3)在最佳頻率處，基底膜的振動響應最大。超過最佳頻率，基底膜位移響應幅值迅速減小。

(4)不同大小聲壓激勵下，基底膜振動的相位響應曲線接近，存在相位滯后。低于最佳頻率，相位響應曲線相對平坦；而超過最佳頻率后，滯后相位迅速增加。

[ 1 ] GEORGVON B. Experiments in hearing [M]. New York: McGraw-Hill Book Company, Inc, 1960.

[ 2 ] RHRODE W S. Observations of the vibration of the basilar membrane in squirrel monkeys using the m?ssbauer technique [J]. The Journal of the Acoustical Society of America, 1971, 49(4): 1218-1231.

[ 3 ] NAM J H, FETTIPLACE R. Optimal Electrical properties of outer hair cells ensure cochlear Amplification [J]. PloS one, 2012, 7(11): 5437-5451.

[ 4 ] RAMAMOORTHY S, NUTTALL A L. Outer hair cell somatic electromotility in vivo and power transfer to the organ of corti [J]. Biophysical Journal, 2012, 102(3): 388-398.

[ 5 ] NUTTALL A L, DOLAN D F, AVINASH G. Laser doppler velocimetry of basilar membrane vibration [J]. Hearing Research, 1991, 51: 203-214.

[ 6 ] COOPER N P, RHODE W S. Basilar membrane mechanics in the hook region of cat and guinea-pig cochlea [J]. Hearing Research, 1992, 63: 163-190.

[ 7 ] REN T, HE W, GILLESPIE P G. Measurement of cochlear power gain in the sensitive gerbil ear [J]. Nature Communications, 2011, 216(2): 1-7.

[ 8 ] 陳世雄, 宮琴, 金慧君. 用Gammatone濾波器組仿真人耳基底膜的特性 [J]. 清華大學學報(自然科學版), 2008, 48(6): 1044-1048.

CHEN Shixiong,GONG Qin, JIN Huijun. Gammatone filter bank to simulate the characteristics of the human basilar membrane [J]. Journal of Tsinghua University (Science and Technology), 2008, 48(6): 1044-1048.

[ 9 ] GUAN X, GAN R Z. Effect of middle ear fluid on sound transmission and auditory brainstem response in guinea pigs [J]. Hearing Research, 2011, 277(1/2): 96-106.

[10] NUTTALL A L, DOLAN D F. Steady-state sinusoidal velocity responses of the basilar membrane in guinea pig [J]. The Journal of the Acoustical Society of America, 1996, 99(3): 1556-1565.

[11] HALLWORTH R. Passive compliance and active force generation in the guinea pig outer hair cell [J]. Journal of Neurophysiology, 1995, 74(6): 2319-2328.

[12] 武瑾. 噪聲對大鼠耳蝸基底膜AIF表達的影響 [D]. 西安：第四軍醫大學, 2013.

[13] 周雷, 許立富, 塔娜, 等. 豚鼠耳蝸基底膜振動的測試方法 [J]. 復旦學報(醫學版), 2016, 43(1): 74-78.ZHOU Lei, XU Lifu, TA Na, et al. Testing methodology for the vibration in basilar membrane of guinea pig’s cochlea [J]. Fudan University Journal of Medical Sciences, 2016,43(1): 74-78.

[14] 郭夢和, 任田英, NUTTAL A. 正常豚鼠聲刺激誘發的耳蝸基底膜振動 [J]. 第四軍醫大學學報, 1997, 18(5): 58-61.

GUO Menghe, REN Tianying, NUTTAL A. Normal cochlear basilar membrane vibration elicited with sound stimuli in guinea pigs [J]. Journal of the Fourth Military Medical University, 1997, 18(5): 58-61.

[15] 郭夢和. 蝸內直流電對耳蝸基底膜振動的影響 [J]. 中華耳鼻咽喉科雜志, 2001, 18(5): 21-24.

GUO Menghe. Effects of direct current on vibration of cochlear basilar membrane [J]. Chinese Journal of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery, 2001, 18(5):21-24.

[16] CHEN Y, GUAN X, ZHANG T, et al. Measurement of basilar membrane motion during round window stimulation in guinea pigs [J]. Journal of the Association for Research in Otolaryngology, 2014, 15(6): 933-943.

[17] 呂萍. 建立豚鼠耳蝸生物三維數值模型的基礎研究 [D]. 大連：大連醫科大學, 2012.

[18] 王如彬, 周軼, 張志康. 具有延時作用的基底膜主動耦合模型 [J]. 振動與沖擊, 2011, 39(12): 49-53.

WANG Rubin, ZHOU Yi, ZHANG Zhikang. An active coupling model for basilar membrane with time-delay action [J]. Journal of Vibration and Shock, 2011, 39(12): 49-53.

[19] 楊琳, 華誠, 戴培東, 等. Corti器動力學行為的二維有限元分析 [J]. 振動與沖擊, 2008, 27(4): 108-111.

YANG Lin, HUA Cheng, DAI Peidong, et al. Two dimensional FEM analysis for dynamic behavior of an organ of Corti [J].Journal of Vibration and Shock, 2008, 27(4): 108-111.

[20] 沈雙. 內耳前庭半規管平衡機制生物力學模型研究 [D]. 大連：大連理工大學, 2013.

[21] 蘇英鋒, 孫秀珍, 劉迎曦, 等. 豚鼠內耳前庭-半規管生物力學模型研究 [J]. 力學學報, 2015, 47(6): 1065-1072.

SU Yingfeng, SUN Xiuzhen, LIU Yingxi, et al. Biomechanical model of the vetibule and semicircular canals of guinea pig[J]. Chinese Journal of Theoretical and Applied Mechanics, 2015, 47(6):1065-1072.

[22] 蘇英鋒, 孫秀珍, 劉迎曦, 等. 豚鼠耳蝸生物數值模型的實驗研究 [J]. 大連醫科大學學報, 2015, 37(4): 324-327.

SU Yingfeng, SUN Xiuzhen, LIU Yingxi, et al. Establishment of the biomechanical model of cochlea of guinea pig [J]. Journal of Dalian Medical University, 2015, 37(4):324-327.

[23] REN T, NUTTALL A L. Basilar membrane vibration in the basal turn of the sensitive gerbil cochlea [J]. Hearing Research, 2001, 151(1): 48-60.