口腔成纖維細胞生長因子FGF-1對PCNA蛋白及糖尿病頜下腺功能退化的影響

鐘翠翠 張義喜 陳桂英

糖尿病是長期危害人類健康的常見慢性病之一，患者長期的體內水分流失形成多飲、口干等臨床癥狀，由于長期大量飲水和唾液分泌常導致唾液流速加快、唾液內免疫蛋白成分平衡紊亂等現象，長期發展會并發唾液腺功能障礙[1-2]。下頜下腺不僅能分泌唾液，其腺體和導管上皮細胞內含有多種能表達生物活性的物質，同時此類細胞凋亡和增殖的消長可影響腺體分泌功能和組織結構[3]。增殖核細胞抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)是存在于正常增殖細胞或腫瘤細胞內的DNA結合因子，可顯著影響細胞增殖、凋亡[4-5]。成纖維細胞生長因子1(fibroblast grow th factor 1，FGF-1)是成纖維細胞生長因子家族的重要成員，有較強的促增殖作用，能刺激血管生長、加速創傷愈合以及促進神經損傷修復[6]。隨著醫藥研究的深入發現，FGF-1對糖尿病及其并發癥，如糖尿病性口干等的治療效果較為顯著，但是對于FGF-1作用于糖尿病頜下腺組織的作用機制尚無詳細報道[7]。本項研究通過對FGF-1干預糖尿病患者治療后小鼠臨床指標和頜下腺PCNA功能變化進行觀察，獲得了較為顯著的結果，現匯報如下。

1.材料與方法

1.1 儀器和藥品 藥物和試劑FGF-1注射液(1000mg/L，純度＞97%。上海高創化學科技有限公司提供，批號17071102)；血糖儀和血糖試紙(上海羅氏診斷產品有限公司)；HE試劑盒(北京索萊寶生物科技公司)；兔抗鼠PCNA一抗和山羊抗兔二抗(sc-2016，Santa Cruz，美國)；生物組織石蠟包埋機(Leica公司，德國)；石蠟切片機(Leica公司，德國)；電子天平(上海天平儀器廠)；超凈工作臺(Thermo公司，美國)；光學顯微鏡(日本Olympus公司BX50型)；離心機(Beckman公司，美國)；-20℃、-80℃冰箱(Thermo公司，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物來源 2型糖尿病雄性C57BL/6 db/db(糖尿病模型小鼠)小鼠20只，體重18-22g，7-9周。血糖＞18.0mmol/L，全部來自于陽谷縣人民醫院實驗動物生命科學研究組(具有動物培養合格證)。另選10只8周齡的雄性db/m(非糖尿病模型小鼠)小鼠作為對照組。

1.2.2 動物分組方法 對照組小鼠不做處理，正常喂養。隨機數字表法將20只db/db小鼠平均分為2組，模型組、實驗組(FGF-1組)，每組10只。3組小鼠各項指標組間比較無顯著統計學差異(P＞0.05)。實驗組小鼠按照2 mg/kg的比例腹腔給藥FGF-1注射液，2次/d，持續給藥觀察16周。模型和對照組小鼠按照同等劑量的生理鹽水，以同樣腹腔給藥的方式對小鼠進行注射。本研究所有小鼠飼養均選擇動物實驗中心環境，喂養普通飼料，飲水和喂食均無特殊要求[8]。

1.2.3 基礎指標檢測 觀察血糖和體重指標水平，從給藥觀察開始，每周第七日定時隨機選取每組小鼠采用電子天平稱量體重并準確登記。血糖檢測后取小鼠斷尾后血樣，血糖測定儀校準檢測血糖值。

1.2.4 唾液流率檢測 從給藥觀察開始，每周第七日定時進行唾液流率檢測。根據小鼠體重計算小鼠麻醉劑量，腹腔給藥10%水合氯醛4m/kg，0.1%毛果蕓香堿0.5mg/kg，等待20min后進行唾液收集。唾液收集取小鼠坐立位，頭向下，將稱量干棉球置于小鼠下頜下腺導管開口處，維持狀態15min后稱重記錄。唾液流率采用棉球吸收唾液后質量減去干棉球質量與小鼠體重的比率計算。

1.2.5 HE染色觀察病理 16周，取小鼠進行水合氯醛麻醉，開胸腔，入左心室到主動脈部，開右心耳。生理鹽水沖洗后多聚甲醛灌注固定，取頜下腺組織，固定24h，乙醇濃度梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，連續切片5μm，進行HE染色并觀察，采用數碼顯微鏡觀察小鼠頜下腺腺泡和組織情況并拍照，觀察頜下腺、黏膜充血、腺體分泌、黏膜充血以及水腫等情況[9]。

1.2.6免疫組織化學染色檢測各組小鼠頜下腺組織中PCNA的表達[10]石蠟切片常規脫蠟，用3%雙氧水-甲醇溶液浸泡，室溫避光孵育20min，0.01%枸櫞酸緩沖液高壓鍋內加熱煮沸2min，抗原修復。分離抗原修復盒，25℃靜置45min，滴加1%山羊血清35μl，于37℃恒溫箱濕盒內孵育30min；用枸櫞酸緩沖溶液洗滌2次后，滴加兔抗鼠PCNA一抗(1∶150)，4℃過夜孵育；用枸櫞酸緩沖溶液洗滌2次后，滴加標記過的山羊抗兔二抗(1∶150)，37℃溫箱濕盒內孵育1h；DAB顯色，蘇木素復染、脫水、封片。光鏡觀察免疫組化染色切片，其中PCNA陽性表達細胞內可見棕黃色粗顆?；蜃攸S色細顆粒分布。分別從三組選取相同數目的切片且切片清晰不重疊。計算視野的可見顯色數目，計算細胞陽性率：細胞陽性率=陽性細胞數÷視野內細胞總數×100%。

1.3 統計學方法 本研究采用統計學軟件SPSS 20.0進行統計學處理，計量資料采用(x±s)表示，進行t檢驗分析，設P＜0.05時差異有統計學意義，具有可比性。

2.結果

2.1 基礎指標檢測 通過對小鼠體重和血糖檢測指標可知，實驗組小鼠體重水平從監測第4周開始有顯著下降(P＜0.01)，與同期模型組相比均顯著較低(P＜0.01)。實驗組小鼠血糖水平從監測第1周開始有顯著下降(P＜0.01)，與同期模型組相比下降有顯著差異(P＜0.01)，從第四周開始，實驗組與對照組相比，無顯著統計學差異(P＞0.05)。具體檢測結果如圖1所示：

圖1 基礎指標檢測小鼠體重和血糖

2.2 唾液流率檢測比較 實驗期間實驗組小鼠唾液流率呈遞增趨勢，且在實驗8和16周時唾液流率均顯著高于同時間點模型組(P＜0.05)，但仍均顯著低于同時間點空白對照組(P＜0.05),如表1所示。

表1 三組小鼠唾液流率對比(mg/(min·kg)，x±s，n=10)

2.3 HE染色觀察頜下腺病理情況 HE染色結果如圖2顯示：實驗組小鼠頜下腺組組織結構清晰，未見明顯病變，腺泡或導管萎縮程度與模型組相比顯著減輕；模型組病變嚴重，腺泡間隔增厚，實驗組纖維化病變情況較模型組輕。對照組小鼠下頜下腺組織腺泡飽滿、腺泡間邊界清晰；腺泡細胞呈錐體形且排列密集，細胞質染色較淺，細胞核呈圓形，靠近細胞基底部；導管組織中，顆粒曲管較多，管腔較大，管壁由單層柱狀上皮細胞圍成，排列整齊，細胞頂部胞質中含大量嗜酸性顆粒。模型組小鼠下頜下腺組織腺泡明顯萎縮，腺泡細胞排列紊亂；導管組織中，顆粒曲管數目減少，管徑變細，有的甚至失去管腔結構，導管細胞排列呈簇狀堆集，細胞頂部胞質中分泌顆粒嗜酸性減弱。

圖2 頜下腺腺泡和導管HE染色(光鏡×400)

2.4免疫組織化學檢測 實驗結果顯示，3組小鼠頜下腺腺泡細胞及導管細胞中均有PCNA存在，尤以顆粒曲管中表達最強，陽性反應物質主要位于腺泡細胞及導管細胞細胞核內。對照組、模型組和實驗組小鼠下頜下腺PCNA細胞陽性率依次是(45.23±7.78)、(11.50±1.69)%、(36.98±6.53)%，組間差異有顯著統計學意義(均P＜0.05)，如圖3所示。

圖3 免疫組織化學檢測頜下腺PCNA抗原的表達(光鏡×400倍放大)

3.討論

糖尿病是全球最主要的一種以全身性代謝紊亂為主慢性內分泌性疾病，隨著病情的發展神經、腦、眼、心、腎等各部分器官并發癥和功能障礙尤其嚴重，對患者生活造成很大不良影響，形成了大規模的社會、醫療、家庭等規模性的發展障礙[11-12]。多飲口干是糖尿病患者主要表現，主要是因為糖尿病患者血糖導致血液滲透壓升高，腎滲透性成尿增多，血容量減少，傳導大腦皮層饑渴反應，形成多飲口干表征[13-14]。長期口干和飲水會激發口腔唾液分泌和唾液腺組織功能損傷，糖尿病患者口腔唾液腺體比正常人負擔重，其中頜下腺功能退化是顯著表現之一[15-16]。長期唾液分泌工作下，糖尿病患者頜下腺、腮腺等腺體疲勞，尤其腺體積縮小，導致腺體唾液流率降低，影響組織和導管營養平衡，導致蛋白質、脂質體、糖分等的代謝失調，使唾液成分和分泌異常。

FGF-1是近年來糖尿病治療藥物應用和關注較多的優勢因子[17]，具有可取代胰島素調節血糖的治療地位。有關胰島素降糖小鼠實驗研究曾經報道，胰島素降糖過程對頜下腺細胞增殖和結構變化均有影響。通過這個結果考慮FGF-1在頜下腺細胞核增殖結構中的作用，研究其在小鼠降糖過程中的基礎指標變化。本研究結果顯示，實驗組小鼠在體重和血糖水平方面均有顯著改善，減肥和降糖趨勢均有持續下降到平穩發展?？梢娫谔悄虿≈委熒螰GF-1已經有了可以與胰島素相比的藥理意義。

試驗中通過對小鼠頜下腺病理觀察發現，糖尿病小鼠頜下腺萎縮明顯，組織學亦觀察到下頜下腺腺泡明顯萎縮，細胞排列紊亂；顆粒曲管導管數目減少，管徑變細[18-19]。FGF-1介入治療的糖尿病小鼠下頜下腺腺體及組織學形態經過16周的維持觀察均逐漸趨于平穩?？梢奆GF-1對逆轉糖尿病型頜下腺功能不良作用。唾液流率檢測結果中，FGF-1介入治療的糖尿病小鼠唾液流率隨著時間延長而逐步增加，提示FGF-1也可逆轉糖尿病導致的下頜下腺功能損傷[20]。糖尿病使頜下腺萎縮的病理機制可能與氧化應激及細胞凋亡相關。氧化應激是糖尿病及其并發癥發生發展的關鍵因素[21]。長期高血糖環境使頜下腺組織中活性氧產生增加，而抗氧化物質不足，機體對氧自由基的清除能力大大減弱，這種動態失衡引起活性氧有害蓄積，對細胞內蛋白質、核酸和脂質等大分子物質造成氧化損傷，從而導致細胞凋亡[22]。

通過本研究對糖尿病小鼠下頜下腺PCNA免疫組織化學檢測表達可知，糖尿病小鼠頜下腺細胞PCNA細胞陽性率顯著下降，而FGF-1給藥組小鼠細胞陽性率顯著高于糖尿病小鼠的細胞表達。這說明糖尿病發病時小鼠頜下腺腺泡和導管活躍度降低，腺體功能減弱。而FGF-1因子的介入使頜下腺PCNA含量顯著增加，直接產生頜下腺腺體增殖功能加強[23]。FGF-1可通過調節血糖緩解氧化應激反應活化磷酸肌醇3激酶和P38靶點，促進分裂原活化蛋白激酶信號通路[24]。與其他類型癌細胞株比較，P38信號通路的的激活可促進AKT、PI3K、mTOR及胞外信號調節激酶P38 MAPK等磷酸化。這是細胞內外信號傳導和刺激誘發PCNA細胞表達的直接作用，對增強細胞分裂和增殖具有作用要意義[25]。

4.結論

通過本研究可知，口腔FGF-1可產生與胰島素相比的降糖效果，對調節機體營養代謝和唾液分泌能力具有顯著療效。同時可通過調節PCNA的表達實現對糖尿病小鼠頜下腺結構萎縮功能退化的逆轉效果。

[1]俞 潔,章功杰,陳松軍,等.糖尿病患者唾液流率與口干相關性研究[J].口腔醫學研究,2016,32(2):177-180

[2] 高瑤潔,范 春,徐麗麗,等.齦溝液β-防御素-2、β-防御素-3在慢性牙周炎與2型糖尿病中的水平研究[J].口腔醫學,2017,37(6):549-553

[3]胡惠貞,賈雪梅,桂 麗,等.糖尿病大鼠下頜下腺內nNOS和NT-3表達變化及意義[J].安徽醫科大學學報,2017(6):796-801

[4]李開亮.辣椒素對131碘放射損傷早期大鼠頜下腺的保護作用及分子機制研究[D].大連醫科大學,2016

[5] 于書娟,黃小艷,王彩虹,等.低濃度雌二醇對骨質疏松大鼠頜骨成骨細胞增殖分化能力的影響[J].口腔頜面修復學雜志,2016,17(1):17-21

[6] 周稚輝,施 璐,郎淼杰,等.成纖維細胞生長因子1對糖尿病小鼠下頜下腺增殖細胞核抗原表達的影響[J].中華口腔醫學雜志,2017,52(5)

[7] Perry R J,Lee S,Ma L,et al.FGF1 and FGF19 reverse diabetes by suppression of the hypothalamic-pituitaryadrenal axis[J].Nature Communications,2015,6:6980

[8]吳彥菊,關一夫.西格列汀對2型糖尿病小鼠胰島β細胞自噬相關因子表達的影響[J].山東醫藥,2015(20):14-17

[9]葉 凡,岳麗珺,范 剛,等.小檗皮水浸膏對db/db糖尿病小鼠視網膜病變的影響(Ⅰ)[J].中國實驗方劑學雜志,2016(2):82-86

[10]劉 潔,張海松,馬永軍,等.Egr-1基因轉染對糖尿病小鼠腎臟炎癥反應的影響[J].中國病理生理雜志,2015,31(9):1688-1692

[11]侯清濤,李 蕓,李舍予,等.全球糖尿病疾病負擔現狀[J].中國糖尿病雜志,2016,24(1):92-96

[12]Zhu L L,Zhang Z,Jiang H S,et al.Superparamagnetic iron oxide nanoparticle targeting of adipose tissue-derived stem cells in diabetes-associated erectile dysfunction[J].Asian Journal of Andrology,2017,18(4):425-432

[13]L?nnrot M,Salminen K,Knip M,et al.Enterovirus RNA in serum is a risk factor for beta-cell autoimmunity and clinical type 1 diabetes:A prospective study[J].Journal of Medical Virology,2015,61(2):214-220

[14]羅愛華,謝 紅,岳朝暉,等.中老年牙周病流行趨勢現狀及其相關危險因素[J].中國老年學,2016,36(17):4334-4335

[15]周明珠,宋淑菊,段 婷.干燥綜合征涎腺超聲評分系統及臨床應用價值[J].中國實用內科雜志,2016(9):810-813

[16]廖 涌.中國糖尿病的流行病學現狀及展望[J].重慶醫科大學學報,2015(7):1042-1045

[17]顏 興,武鴻毅,許 諾,等.放療對小型豬腮腺頜下腺舌下腺微血管損傷影響的實驗研究[J].口腔醫學研究,2017,33(1):15-18

[18]宋 青,喬凌燕,田 飛,等.腺病毒介導鼠胰島素樣生長因子1基因對胰島β細胞的保護作用[J].中國組織工程研究,2012,16(18):3295-3300

[19]盧志山,姜廣水,吳益華,等.變形鏈球菌SBR經頜下腺免疫小鼠后局部神經生長因子和白介素-5表達變化[J].口腔醫學,2004,24(3):129-131

[20]金 丹,徐 亮,龔建平,等.正常人頜下腺位置的多層螺旋CT定量評價[J].臨床放射學雜志,2017,36(2):184-187

[21]李素娟,王加林,王 鵬,等.波動性高血糖對糖尿病大鼠肝臟功能、病理形態學的影響及其機制探討[J].山東醫藥,2015(24):35-36

[22]萬 強,劉中勇.丹參酮ⅡA對脂質運載蛋白2誘導人臍靜脈內皮細胞損傷的影響研究[J].中國全科醫學,2016,19(9):1086-1090

[23]趙京山,方明星,郭淺妤,等.羥基紅花黃色素A通過影響PCNA表達和MEK-ERK1/2信號通路抑制大鼠血管平滑肌細胞增殖[J].中國藥理學通報,2015(7):984-988

[24]馬 斌,楊 樂,孫 剛,等.磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路特異性抑制劑RAD001和LY294002對不同分子特征人乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響[J].中華實驗外科雜志,2015,32(9):2143-2145

[25]王 瀟,王志敏,張飛旭,等.絨山羊胎兒成纖維細胞和成體干細胞體外生長特性的比較[J].基因組學與應用生物學,2017(2):582-588