雌激素缺乏大鼠根尖周炎病變區HMGB1的表達*

關曉月 錢 華 關永暉 古麗努爾·阿吾提

根尖周炎是口腔疾病中常見的細菌感染性疾病，多繼發于齲病及牙髓病，其病理主要表現為根尖周病變區牙槽骨炎性破壞[1]。高遷移率族蛋白盒1(high mobility group box 1,HMGB1)是一種非組蛋白染色體蛋白，廣泛分布于真核細胞的細胞核中，調節細胞分化、基因轉錄等[2]。HMGB1作為一種重要的晚期炎性介質，對維持和延長機體內炎癥反應有重要的作用[3]。研究發現，當單核細胞及巨噬細胞受到內毒素(Lipopolysaccharide,LPS)刺激，可分泌產生有活性的HMGB1，并促其發揮炎癥細胞因子的作用[4]。HMGB1可少量表達于正常根尖周組織，然而，在炎癥根尖周組織中HMGB1的表達呈強陽性[5]。雌激素對全身骨代謝起著重要作用，雌激素能夠刺激成骨細胞制造骨基質；當體內雌激素水平降低時，破骨細胞的數量增多，活性增強，促進骨吸收。雌激素缺乏時，可加劇大鼠根尖周炎病變區炎性骨吸收[6]。近年來，有研究顯示，雌激素水平的改變可影響HMGB1的表達[7-9]。然而，當雌激素缺乏時，大鼠根尖周炎病變區炎性細胞浸潤及骨破壞程度的加劇，是否與HMGB1的表達變化相關，目前尚未可知。本次實驗擬通過建立卵巢去勢大鼠根尖周炎模型，觀察雌激素缺乏對大鼠根尖周炎模型中HMGB1表達的影響。

1.材料及方法

1.1 材料購置40只12-16周齡，體重200g-220g的健康雌性SD大鼠，由新疆醫科大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SYXK(新)2015-0002。將大鼠隨機分為兩組，OVX組及SHAM組，每組20只。主要試劑：戊巴比妥鈉(Sigma,美國)，Trap試劑盒(Sigma,美國),HMGB1兔抗鼠多克隆抗體(Abcam,美國),二抗SP試劑盒及DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 卵巢摘除術所購置大鼠于同等環境中適應性喂養1周。在兩名助手幫助下，向大鼠腹腔內推入0.3%(3ml/kg)戊巴比妥鈉行全身麻醉，大鼠取仰臥位固定于手術臺，在腰肌與肋緣相交處備皮，常規消毒，縱向切開組織、切除卵巢，徹底止血，縫合。SHAM組僅切除卵巢周圍附著的卵巢大小脂肪組織，常規消炎，關閉腹腔。給予術后護理，定期補給飲用水及鼠糧，每日更換墊料。

1.2.2 根尖周炎模型制備及樣本處理

卵巢摘除術后一周[10]，行根尖周炎模型制備，麻醉方法同上。大鼠取仰臥位，固定四肢及上頜。使用1/2#球鉆對雙側下頜第一磨牙遠中窩處開髓，探及穿髓點后即停止，防止底穿，隨后將髓腔直接暴露于口腔環境中。髓腔開放后0d、7d、14d、21d時，OVX組及SHAM組均隨機挑選5只大鼠，全麻下內眥靜脈取血3-5ml，分離下頜骨，脫頸處死。修整下頜骨并清理后，10%EDTA 4℃下緩慢脫鈣。二甲苯浸泡，常規梯度酒精脫水，正丁醇透明，石蠟包埋。對標本行頰舌向連續切片，切片厚約5um,以切至第一磨牙遠中根根尖孔為標準。對包含下頜第一磨牙遠中根尖孔的切片行HE染色、酶組織化學染色、免疫組織化學染色并分析結果。

1.2.3 血清雌激素水平檢測 大鼠腹內眥靜脈血置入2ml EP管，4℃下，1000r/min離心20min,分離血清，放射免疫法檢測血清中雌激素水平。

1.2.4 HE染色 組織學染色時，OVX組及SHAM組于0d、7d、14d、21d時，各選取3個樣本，每樣本隨機選取3張切片行常規HE染色，光鏡下觀察根尖周骨骨破壞范圍及炎性浸潤程度。

1.2.5 酶組織化學染色 抗酒石酸酸性磷酸酶(Trap)是破骨細胞特異的生化標志物[11]。各實驗分組于0d、7d、14d、21d隨機挑選出三個樣本。將所選標本置于60℃溫箱烤片1h，蒸餾水預熱，二甲苯I,II脫蠟，下行梯度酒精脫水，37℃下Trap染液孵育1h，蘇木素染色，細胞核返藍，封片。光鏡下觀察破骨細胞形態及數目。陰性對照使用PBS。

1.2.6 免疫組織化學染色及分析 各實驗分組于0d、7d、14d、21d隨機挑選出三個樣本。各樣本置于二甲苯中常規脫蠟，梯度酒精入水，37℃下胃蛋白酶消化20min,消除內源性過氧化物酶，PBS洗5min×3次，血清封閉，滴加一抗，HMGB1兔抗鼠多克隆抗體 (1∶500)，4℃過夜。滴加二抗，DAB顯色，蘇木素復染。陰性對照以PBS代替一抗。

1.2.7 細胞計數及統計學分析 OVX組及SHAM組大鼠血清雌激素水平采用Graphpad軟件進行統計分析。對于Trap染色及免疫組織化學染色結果，采用雙盲法在高倍視野下(400×)隨機選取根尖周病變區的5個視野對破骨細胞及HMGB1陽性細胞進行計數，計算平均值。數據均以x±s表示，采用SPSS 17.0統計軟件對實驗數據進行統計學分析。各組間比較采用方差分析和t檢驗，檢驗水準a=0.05。

2.結果

2.1 血清雌激素水平 SHAM組血清雌激素水平在實驗全程中處于較為穩定，無明顯改變(-39.89±6.72pg/mL)；行雙側卵巢切除術的OVX組，術后第7d血清雌激素水平急劇降低，14d及21d時OVX組血清雌激素水平較7d組無明顯差異，穩定保持在較低水平(-10.36pg±2.10pg/mL)。

2.2 組織學觀察 HE染色可觀察大鼠實驗性根尖周炎模型病變區骨缺損范圍及炎性細胞浸潤狀態。本次實驗中，髓腔開放0d時，大鼠下頜第一磨牙根尖周組織結構完整，無炎性吸收及骨破壞。髓腔開放7d時，兩組模型根尖周組織可見以中性粒細胞為主的炎性細胞浸潤，牙槽骨輕度吸收呈蟲蝕狀。髓腔開放14d時，兩實驗組下頜第一磨牙牙髓組織基本全部壞死，根尖周病變區多種炎性細胞浸潤加重，牙槽骨吸收較7d時進一步加重。髓腔開放后21d時，根尖周病變區炎癥進一步增強，出現以淋巴細胞及中性粒細胞為主的炎性細胞大面積浸潤，形成根尖膿腫，牙槽骨吸收于此時達到最大值。本實驗中，OVX組大鼠開髓后7d,14d及21d，其根尖周組織炎性細胞浸潤程度及牙槽骨破壞范圍均較SHAM組顯著(圖1)。

圖1 根尖周組織HE染色及酶組織化學染色結果

2.3 酶組織化學染色結果 Trap陽性細胞胞質呈深紅色/紫色，胞核呈藍色。在Trap染色中具有兩個或兩個以上細胞核的陽性細胞即為破骨細胞。Trap染色結果顯示，破骨細胞多分布于根尖周炎病變區骨破壞前沿。兩組大鼠開髓后0d,7d,14d及21d時，其根尖周病變區均可見破骨細胞的表達。破骨細胞數目自開髓后0-14d逐漸增多，并于14d時達到頂峰，21d時其數目發生減少。模型建立后0d，7d及14d時，OVX組破骨細胞數目較SHAM組增加顯著(P＜0.05)(見圖2)。

圖2 根尖周組織酶組織化學染色結果

2.4 HMGB1免疫組織化學染色結果 免疫組織化學染色結果顯示，髓腔開放后0d，OVX組及SHAM組大鼠根尖周組織中均可少量表達HMGB1，且HMGB1主要分布于細胞核內，輕微表達于細胞胞漿。大鼠髓腔開放后7d，HMGB1胞核著色的陽性細胞數數目增加，且細胞胞漿對于HMGB1的陽性表達顯著升高。開髓后14d,21d時，兩組大鼠根尖周炎病變區胞核著色陽性細胞數較7d時減少,但胞漿HMGB1陽性著色持續增多，且于21d時胞漿呈HMGB1陽性著色的細胞數目達到最大值。自根尖周炎模型建立起的7d,14d,21d,OVX組大鼠根尖周炎病變區HMGB1胞漿著色的陽性細胞數顯著高于SHAM組，具有統計學意義(P＜0.05)(見圖 3)。

圖3 根尖周組織免疫組織化學染色結果(×400)

3.討論

雌激素在全身骨代謝的過程中發揮了重要作用,雌激素的缺乏可通過調控IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-11,M-CSF,Prostaglandin E(PGE)等細胞因子促進破骨細胞的生成，促進骨吸收[12-15]。本次試驗對OVX組進行雙側卵巢切除，通過測量OVX組及SHAM組大鼠血清雌激素水平，判定成功建立大鼠雌激素缺乏模型，OVX組血清雌激素水平約為(-10.36pg±2.10pg/mL),SHAM組約為(-39.89±6.72pg/mL)。組織化學染色發現，隨時間推移，OVX組根尖周組織炎性細胞浸潤及骨破壞面積均較SHAM組顯著。另外，酶組織化學染色結果顯示，血清雌激素水平的降低，可促進破骨細胞的形成及功能行使，大鼠開髓后0d、7d、14d時，OVX組根尖周組織破骨細胞數目明顯多于SHAM組(P＜0.05)。以上結果與Zhang et al.關于雌激素缺乏對大鼠根尖周炎的作用的描述相一致[16]。

HMGB1作為一種DNA伴隨因子存在于多種真核細胞的細胞核中，當機體發生細胞損傷、壞死及炎癥時，HMGB1可從細胞核中脫離進入胞質中，發揮其生物學效應[18]。HMGB1與多種促炎因子之間存在相互影響，如采用LPS，IL-1β、TNF-α刺激巨噬細胞及單核細胞時，可促進HMGB1的產生，而當使用HMGB1刺激巨噬細胞及單核細胞，亦可加強IL-1β、IL-6、TNF-α的產生[3,4]。此外,HMGB1的產生及分泌與骨組織改建存在一定聯系，破骨細胞及成骨細胞中均可檢測到HMGB1的表達[19]。研究人員證實，HMGB1不僅可通過結合RANKL DNA序列上調TNF-α轉錄，另外亦促使低于閾值濃度的RANKL誘導破骨細胞生成[20,21]。根尖周炎作為口腔常見炎性骨吸收疾病，HMGB1參與了其發生發展過程[5,22]。本文通過免疫組織化學染色觀察HMGB1在大鼠根尖周炎病變區的表達，SHAM組大鼠根尖周炎病變區HMGB1的表達結果與賈彤彤等一致[22]，即自開髓后0-21d，大鼠根尖周胞質染色的HMGB1陽性細胞數逐漸增加，于21d時達到最大值。OVX組大鼠于髓腔暴露后7d、14d及21d時，其根尖周HMGB1陽性細胞數較SHAM組明顯增高，且具有統計學意義(P＜0.05)，本研究證實雌激素缺乏可增強大鼠根尖周病變區HMGB1的表達。

雌激素對于HMGB1的作用已在研究中得以探討，Gonda等[23]發現HMGB1可通過與雌激素受體的結合，增強雌激素效應。此外，使用雌激素刺激雌激素敏感細胞時，可觀察到其細胞周期動力學分布異常，同時伴有HMGB1的高表達[7,8]。本文僅通過免疫組織化學染色證實雌激素缺乏可影響大鼠根尖周炎病變區HMGB1的表達，未說明雌激素缺乏是通過何種途徑調控HMGB1的表達。此外，大鼠根尖周炎病變區HMGB1表達與其它炎性因子，如TNF-α,IL-1β及IL-6等之間的交互作用亦未得到開展研究。

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