密度梯度離心法結合上游法優化精液對體外受精-胚胎移植臨床結局的影響*

吳 斌，許文太，周洪貴（1.川北醫學院附屬醫院婦產科，四川南充637000；.解放軍第101醫院生殖醫學中心，江蘇無錫14000）

體外受精-胚胎移植（IVF-ET）技術也稱“試管嬰兒”技術，是當今治療不孕不育的重要方法，精液優化處理作為IVF-ET技術（ART）的關鍵步驟之一，其目的是分離出精液中的精漿，除去畸形精子、死精子、細胞碎片及其他有害的物質，最終優選出一定數量成熟且具有受精潛能的前線運動精子[1]。目前，臨床上常用的優選方法主要包括上游法、密度梯度離心（DGC）法等。本研究比較了DGC法、上游法及DGC結合上游法處理精子的IVF-ET臨床結局，旨在為優化IVF-ET技術過程中精子處理方法提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇解放軍第101醫院生殖醫學中心2013年12月至2016年3月施行IVF-ET助孕的共206個IVF-ET治療周期的患者，對其臨床資料進行回顧性分析。納入病例的不孕原因包括：盆腔、輸卵管因素、免疫性因素、不明原因[2]。排除標準為男方中重度精子少、弱、畸形精子癥患者。其中104個周期采用DGC法處理精液，為實驗1組；30個周期采用上游法處理精子，為實驗2組；72個周期采用DGC法結合上游法處理精子，為實驗3組。

表3 3組患者的IVF-ET結局比較[%（n/n）]

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 女方給予常規促排卵方案[3]，待體內卵泡發育成熟后對其注射人絨毛膜促性腺激素（HCG），劑量為 5 000 U 或 10 000 U，35～36 h后，經陰道超聲引導下行卵泡穿刺取卵。男方禁欲2～7 d后在女方取卵手術當天通過手淫法取精液[4]，收集于無菌取精杯中，液化后待處理。

1.2.2 DGC法[5]將Isolate精子梯度液（美國Irvine）的下層液（濃度80%）加入15 mL至錐底離心管底部，再將同體積濃度為40%的上層液緩慢置于其上，上下層可見明顯分界面，再沿壁緩慢加入1.5 mL已液化的精液，1 338 r/min離心15 min，棄除上下層梯度液和精漿，精子沉淀物用人輸卵管受精液（HTF，Quinn′s Advantage?Fertilization media）1 092 r/min離心洗滌 2次，棄上層，補充HTF液至1 mL，混勻后置于37℃、5%CO2培養箱內備用。

1.2.3 上游法[5]將液化后的精液充分混勻后，取1 mL加入5mL的圓底試管底部，在其上分層加入HTF液2mL，將離心管傾斜45°，置入37℃培養箱，培養上游30～60 min（時間根據精液質量來調整），避免晃動。用巴士德吸管吸出上層呈云霧狀的液體，移入另一支圓底試管，添加HTF液 2 mL，混勻，1 092 r/min離心 5 min。吸出上清液，加HTF液0.5 mL，輕彈管底，使沉淀松散。分層加入HTF液1 mL，45°傾斜，置于37℃培養箱內20 min，吸取上部精子懸液，調整濃度，置入37℃培養箱待受精用。1.2.4 DGC法結合上游法 先用密度梯度離心液處理，棄除精漿和2層梯度液后，加HTF液2 mL混勻，1 092 r/min離心5 min，棄上清；再加HTF液0.3 mL，輕彈管底，使沉淀松散，分層加入HTF液1 mL，45°傾斜，置于37℃培養箱內30 min，吸取上部精子懸液轉入另一支錐底離心管內，加HTF液1 mL混勻，調整精子濃度備用。

1.2.5 體外受精、胚胎培養和移植 3組均于取卵后3～5 h，將優化好的精子加入到含有卵子的培養皿中，調整好精子濃度，在37℃、5%CO2培養箱中共培養16～20 h后，機械法脫顆粒觀察受精情況，第3天觀察卵裂情況并記錄，胚胎評分后行胚胎移植或胚胎冷凍。

1.2.6 胚胎評分標準 根據細胞數、細胞大小均勻與否、碎片多少等情況，參照2010年美國輔助生殖技術協會（SART）的胚胎評分系統[6]進行卵裂期胚胎質量評分，見表1。評分結果Ⅰ級或Ⅱ級的為優質胚胎。受精率=受精胚胎數/獲卵數；優質胚胎率=優質胚胎數/正常受精卵裂數；胚胎種植率=著床胚胎總數/移植胚胎總數。移植后28 d B超檢測到孕囊和胎心即為臨床妊娠，臨床妊娠率=妊娠周期數/移植周期數。

表1 卵裂期胚胎評分標準

1.3 統計學處理 應用SPSS19.0進行統計學分析，定量資料正態分布的數據以±s表示，采用t檢驗；率的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 3 組患者的基本情況比較 3組患者女方年齡、不孕年限、男方年齡及獲卵數比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 3組患者的基本情況比較（±s）

表2 3組患者的基本情況比較（±s）

基本情況女方年齡（歲）不孕年限（年）男方年齡（歲）獲卵數（個）實驗1組31.58±3.70 4.53±2.45 32.45±3.80 8.14±5.64實驗2組30.88±3.86 4.80±2.34 31.86±3.50 8.56±5.42實驗3組31.35±3.50 5.49±3.10 32.72±3.45 8.45±6.32

2.2 3 組患者的IVF-ET結局比較 實驗3組的受精率顯著高于實驗1組，差異有統計學意義（P＜0.05），高于實驗2組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。3組優質胚胎率、胚胎種植率、臨床妊娠率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），見表3。

3 討 論

精子被多種精液中的多種成分保護，如精漿、上皮細胞、未成熟或死的精細胞、紅細胞、白細胞，甚至細菌，產生毒素或生物活性物質[7]，如去能因子或氧自由基，損害受精能力[8-9]?；谝陨显?，洗滌分離精子是非常必要的。

目前有多種方法用于分離活動的且形態正常的精子用于體外受精，應用最廣泛的是DGC法和上游法[10]，上游法的原理是活動精子有向上游到培養液中的能力，從而將活動精子與死精子、白細胞及雜質分開，其可顯著提高精子活動率、存活率、正常形態百分率，操作簡便，成本低廉，但是精子的回收率低[11]。DGC法的原理：用一定的介質在離心管內形成連續或非連續密度梯度，將精液置于介質的頂部，通過離心力場的作用使精子與精液其他組分分層、分離。本研究采用2層濃度分別為80%和40%的非連續密度梯度離心液，具有不同懸浮密度的細胞及其他類型的顆粒會慢慢沉淀至密度較高的溶液，離心將會加快其沉淀速度，由于DNA濃縮后的成熟精子密度高于80%，因而離心后活動力強的成熟精子可以通過這層液體到達離心管底部，而其他類型的細胞包括未成熟精子就會在40%和80%的液體交界面上終止沉淀[1]。已證實，與上游法比較，DGC法能回收更多形態正常的精子，并明顯增加精子的活力和體外存活能力，尤其對于重度少、弱及畸形精子癥，冷凍復蘇后的精液可提高回收率[12-13]。ZINI等[14]和SAKKAS等[15]報道，DGC法可去除染色體濃縮差和DNA斷裂的精子。EREL等[16]還認為處理質量較差的精液，DGC法得到精子的存活率、核成熟度和頂體反應率均高于上游法。

KARAMAHMUTOGLU等[17]研究使用DGC法結合上游法處理精液可以提高宮腔內人工授精周期的妊娠成功率。XUE等[18]報道DGC法結合上游法可以富集畸形精子癥患者的形態正常、DNA完整的精子。STEVANATO等[19]和GHUMMAN等[20]的研究均顯示DGC法結合上游法和上游法均可以收集較健康的精子，減少凋亡或DNA損傷的精子。KIM等[21]研究結果顯示，DGC法結合上游法與上游法比較，臨床妊娠率并無顯著差異?；谝陨涎芯?，本中心繼續探索了更理想的精液處理方法，DGC法結合上游法是在傳統的非連續密度梯度離心后增加一個上游篩選過程。結合了2種精子處理方法的優點，精子回收率高且能對回收的精子二次篩選，不增加精子的DNA損傷，從而保證了用于體外受精的精子質量。

本研究分析比較了3種精液處理方法的受精率、優質胚胎率、胚胎種植率和臨床妊娠率，結果顯示，DGC法結合上游法的受精率高于單純的DGC法，可能是由于精子穿過2層非連續梯度液到達離心管的底部，而精漿被隔離在梯度液上面，精液中影響受精和影響胚胎質量的成分被有效地去除，精子沉淀物用受精液離心洗滌1次，也可基本去除沉淀物中的梯度液，最后沉淀精子團還可能含有染色體濃縮差和DNA斷裂的精子，接著精子團被轉入含有HTF液的離心管底部，37℃孵育上游30 min，質量較好的精子分布在上層?？偟膩碚f，受精用的上層精子活力相對較好、精漿成分去除較徹底、核成熟度好、染色質完整性好。然而，本研究的3個實驗組的優質胚胎率、胚胎種植率和臨床妊娠率并無統計學上的顯著差異，原因可能與本研究例數較少，抽樣誤差較大有關，今后需要增加樣本例數進一步研究。

綜上所述，作者認為DGC法結合上游法能篩選出活力、形態足夠好和DNA損傷小的精子，值得在IVFET治療中推廣應用。

[1]黃國寧.輔助生殖實驗室技術[M].北京：人民衛生出版社，2014：62-63.

[2]中華醫學會，黃荷鳳.臨床診療指南-輔助生殖技術與精子庫分冊[M].北京：人民衛生出版社，2009：33-37.

[3]陳瑞玲，李慶琨，韋相才，等.體外受精-胚胎移植術中使用冷凍供精及夫精的臨床效果觀察[J].中國男科學雜志，2003，17（4）：264-266.

[4]BRINSDEN PR.Texmook of in vitro fertilization and assisied reproduction[M].北京：人民衛生出版社，2009：22-234.

[5]World Health Organization.WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen[M].5th ed.Cambridge：Cambridge University Press，2010：138-139.

[6]RACOWSKY C，VERNON M，MAYER J，et al.Standardization of grading embryo morphology[J].J Assist Reprod Genet，2010，27（8）：437-439.

[7]ARAKI Y，YAO T，ASAYAMA Y，et al.Single human sperm cryopreservation method using hollow-core agarose capsules[J].Fertil Steril，2015，104（4）：1004-1009.

[8]LYU BN，ISMAILOV SB，ISMAILOV B，et al.Mitochondrial concept of leukemogenesis：key role of oxygen-peroxide effects[J].Theor Biol Med Model，2008，5：23.

[9]FORD WC.Regulation of sperm function by reactive oxygen species[J].Hum Reprod Update，2004，10（5）：387-399.

[10]PRAKASH P，LEYKIN L，CHEN Z，et al.Preparation by differential gradient centrifugation is better than swim up in selecting sperm with normal morphology（strict criteria）[J].Fertil Steril，1998，69（4）：722-726.

[11]ESTEVES SC，SHARMA RK，THOMAS AJ，et al.Improvement in motion characteristics and acrosome status in cryopreserved human spermatozoa by swim-up processing before freezing[J].Hum Reprod，2000，15（10）：2173-2179.

[12]CLAASSENS OE，MENKVELD R，HARRISON KL.Evaluation of three substitutes for Percoll in sperm isolation by density gradient centrifugation[J].Hum Reprod，1998，13（11）：3139-3143.

[13]HERNANDEZ-LOPEZ L，UMLAND N，MONDRAGON-CEBALLO S，et al.Comparison of the effects of percoll and puresperm on the common marmoset semen[J].J Med Primatol，2005，34（2）：86-90.

[14]ZINI A，FINELLI A，PHANG D，et al.Influence of semen processing technique on human sperm DNA integrity[J].Urology，2000，56（6）：1081-1084.

[15]SAKKAS D，MANICARDI GC，TOMLINSON M，et al.The use of two density gradient centrifugation techniques and the swim-up method to separate spermatozoa with chromatin and nuclear DNA anomalies[J].Hum Reprod，2000，15（5）：1112-1116.

[16]EREL CT，SENTURK LM，IREZ T，et al.Sperm-preparation techniques for men with normal and abnormal semen analysis.A comparison[J].J Reprod Med，2000，45（11）：917-922.

[17]KARAMAHMUTOGLU H，ERDEM A，ERDEM M，et al.The gradient technique improves success rates in intrauterine insemination cycles of unexplained subfertile couples when compared to swim up technique；a prospective randomized study[J].J Assist Reprod Genet，2014，31（9）：1139-1145.

[18]XUE X，WANG WS，SHI JZ，et al.Efficacy of swim-up versus density gradient centrifugation in improving sperm deformity rate and DNA fragmentation index in semen samples from teratozoospermic patients[J].J Assist Reprod Genet，2014，31（9）：1161-1166.

[19]STEVANATO J，BERTOLLA RP，BARRADAS V，et al.Semen processing by density gradient centrifugation does not improve sperm apoptotic deoxyribonucleic acid fragmentation rates[J].Fertil Steril，2008，90（3）：889-890.

[20]GHUMMAN S，ADIGA SK，UPADHYA D，et al.Combination of swimup and density gradient separation methods effectively eliminate DNA damaged sperm[J].J Turk Ger Gynecol Assoc，2011，12（3）：148-152.

[21]KIM EK，KIM EH，KIM EA，et al.Comparison of the effect of different media on the clinical outcomes of the density-gradient centrifugation/swim-up and swim-up methods[J].Clin Exp Reprod Med，2015，42（1）：22-29.