褪黑素尾靜注對缺血性腦卒中大鼠腦損傷的修復作用觀察

衣昕，劉慧慧，肖國棟

(1南通大學醫學院，江蘇南通 226001；2蘇州大學附屬第二醫院)

中風是世界范圍內第三大死因，是成人慢性致殘的主要原因[1,2]。缺血性腦卒中約占所有中風的70%。缺血性腦卒中引起腦損傷涉及的分子機制主要包括興奮性毒性、氧化應激、炎癥、細胞凋亡和周邊極化去極化[3～7]。盡管許多神經保護劑在動物模型驗證有效果，但是仍未應用于臨床。以往研究[8,9]表明，缺血缺氧可以刺激腦內源性神經干細胞(NSCs)的增殖，但是活化的NSCs不能分化成為損傷皮層成熟的神經元。褪黑素是一種有效的自由基清除劑及間接抗氧化劑，可以去除單態氧、超氧陰離子自由基、氫過氧化物、羥自由基和脂質過氧化物自由基[10,11]。那么，缺血性腦卒中時，應用褪黑素治療，能否減輕氧化應激，從而保護細胞以免凋亡，并促進新生神經元的成熟呢？目前國內外鮮見報道。本研究觀察了褪黑素對缺血性腦卒中大鼠腦損傷的修復作用，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠36只，雌雄不拘，體質量200～220 g，購自蘇州大學動物實驗中心。

1.2 褪黑素、試劑、儀器及圖像軟件 褪黑素(6 mg/mL，15 mg/kg)；TUNEL試劑盒，多克隆抗體(1∶200)，小鼠抗NeuN單克隆抗體(1∶500)，1∶200稀釋鼠抗BrdU單克隆抗體，山羊抗兔IgG(1∶800)，山羊抗小鼠IgG (1∶800)，Alexa Fluor?568標記的山羊抗兔IgG(1∶1 000)；激光多普勒血流儀(Moor VSM-LDF)，Leica CM1950恒冷箱冰凍切片機；Image J圖像軟件。

1.3 實驗動物分組、模型制備及褪黑素應用 36只大鼠隨機分為藥物組、模型組、對照組各12只。藥物組、模型組大鼠均制備缺血性腦卒中模型，即應用短暫性大腦中動脈閉塞(tMCAO)法[12]制備。大鼠麻醉后，在右側大腦中動脈的腔內置入經硅樹脂包被的尼龍單絲(6-0尼龍)閉塞血管，閉塞60 min后撤回單絲，誘導短暫局灶性腦缺血灌注。通過激光多普勒血流儀測量局灶性腦血流減少至<20%，表明模型制備成功。對照組大鼠只暴露動脈不閉塞血管。制模過程中和制模后用加熱墊控制大鼠體溫，并保持在37 ℃，直到麻醉大鼠完全恢復清醒。然后將大鼠放回飼養籠，自由飲水進食。tMCAO后72 h內沒有動物發生死亡。制模后5 min、24 h、48 h藥物組大鼠尾靜脈注射溶于含有4%酒精生理鹽水的褪黑素(6 mg/mL，15 mg/kg)，模型組制模后各時點分別給予等量含有4%酒精的生理鹽水。3組大鼠制模后1～3 d連續尾靜脈注射50 mg/kg的5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU，2次/d)以標記新生神經元。

1.4 大鼠腦梗死體積估算 采用TTC染色法。制模后28 d，各組取6只大鼠施以麻醉，迅速取新鮮腦，行冠狀位冰凍切片(1 mm)，切片避光置于1%的TTC磷酸鹽緩沖液中，37 ℃下孵育30 min。使用Image J圖像軟件估算腦梗死體積百分比。

1.5 灌注取材 制模后28 d，各組取剩余6只大鼠，麻醉后以4%甲醛灌注取腦，依次以20%、30%蔗糖脫水后，行冠狀位冰凍切片(30 μm)，切片貼于涂有明膠的載玻片上待用，部分用于TUNEL染色，部分用于免疫熒光。

1.6 大鼠腦組織凋亡細胞計數 采用TUNEL染色法。取上述各組載玻片上的相應切片，依據TUNEL試劑盒的操作說明，進行TUNEL染色檢測凋亡細胞，使用Image J圖像軟件計算凋亡指數(AI)，AI為TUNEL陽性細胞數占觀測范圍內細胞總數的百分比。

1.7 大鼠腦組織損傷區新生神經元前體細胞、新生成熟神經元計數 采用DCX/BrdU免疫熒光雙標檢測損傷區腦組織新生神經元前體細胞數量,NeuN/BrdU免疫熒光雙標檢測損傷區腦組織新生成熟神經元數量。取上述各組載玻片上的相應切片，用0.01 mol/L的PBS(pH7.2)漂洗，每張切片滴加10%山羊血清50 μL封閉過夜，之后每張切片滴加稀釋的兔抗DCX的多克隆抗體(1∶200)、小鼠抗NeuN單克隆抗體(1∶500)和1∶200稀釋鼠抗BrdU單克隆抗體50 μL，4 ℃濕盒孵育24 h。用0.01 mol/L的PBS(pH7.2)漂洗3遍，在避光條件下，每張切片滴加Alexa Fluor?488標記的山羊抗兔IgG(1∶800)、Alexa Fluor?488標記的山羊抗小鼠IgG(1∶800)和Alexa Fluor?568標記的山羊抗兔IgG(1∶1 000)50 μL，4 ℃濕盒孵育24 h。在避光條件下，PBS洗片3遍后，中性甘油封片。先后在激發光波長為495 nm、吸收光波長為520 nm及激發光波長為578 nm、吸收光波長為603 nm的熒光顯微鏡下觀察DCX、NeuN與BrdU陽性的免疫熒光細胞，并攝片。使用Image J圖像軟件計算400倍視野下DCX/BrdU或NeuN/BrdU免疫熒光雙標陽性細胞數量百分比。

2 結果

2.1 各組腦梗死體積比較 藥物組和模型組大鼠腦組織損傷區域呈灰白色；對照組大鼠腦組織呈紅色，未見損傷區域。藥物組、模型組、對照組大鼠腦梗死體積百分比分別占20.09%±2.17%、32.11%±4.65%、0，藥物組與模型組比較，P<0.05。

2.2 各組腦組織凋亡細胞計數比較 藥物組、模型組、對照組AI分別為7.51%±1.21%、14.12%±1.89%、1.00%±0.12%，藥物組分別與模型組、對照組比較，P均<0.05。

2.3 各組新生神經元前體細胞數量比較 藥物組大鼠腦組織損傷區域可見到較多的DCX/BrdU雙標陽性的神經元前體細胞，模型組腦組織損傷區域可見到少量DCX/BrdU雙標陽性的神經元前體細胞，對照組大鼠腦組織幾乎未見到DCX/BrdU雙標陽性的神經元前體細胞；藥物組、模型組、對照組DCX/BrdU雙標陽性神經元前體細胞分別占14.01%±2.89%、5.02%±1.61%、0，模型組分別與藥物組、對照組比較，P均<0.05。

2.4 各組新生成熟神經元數量比較 藥物組大鼠腦組織損傷區域可見到較多的NeuN/BrdU雙標陽性的神經元，模型組大鼠腦組織損傷區域可見到少量NeuN/BrdU雙標陽性的神經元，對照組大鼠腦組織幾乎未見NeuN/BrdU雙標陽性的神經元；藥物組、模型組、對照組NeuN/BrdU雙標陽性新生成熟神經元分別占10.58%±1.02%、2.25%±0.18%、藥物組與模型組比較，P<0.05。

3 討論

缺血性腦卒中是一種常見但嚴重的疾病，病死率為15%，多達25%的患者出現癲癇、腦癱或發育遲緩，給家庭和社會造成沉重的負擔[13,14]。在細胞水平上，大腦缺血后啟動了一系列生化事件，從氧化代謝到無氧代謝，細胞內鈣的積聚，線粒體功能障礙，自由基的產生和炎癥，從而導致廣泛的細胞凋亡[15～17]。神經元是缺血最敏感的細胞，表現出選擇性的脆弱性[18,19]。目前，對于缺血性腦卒中的治療臨床主要以神經保護以及對癥治療為主，但是缺乏有效的治療手段來修復受損的腦組織，而且無法達到根治的目的。這就促使研究人員將NSCs作為潛在的替代丟失細胞的來源。以前的研究表明，缺血缺氧可以刺激內源性NSCs的增殖，但是活化的NSCs不能分化成為損傷皮層成熟的神經元[8,9]。因此，如何促進增殖的內源性NSCs分化為成熟的神經元具有重要意義。

褪黑素是一種有效的自由基清除劑及間接抗氧化劑，可以去除單線態氧、超氧陰離子自由基、氫過氧化物、羥基自由基和脂質過氧化物自由基[10,11]。褪黑素通過激活最重要的抗氧化酶包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶，并通過提高線粒體電子傳遞的效率而起到間接抗氧化劑的作用[20,21]。褪黑素是一種主要由松果體分泌的親脂性神經激素，可以自由穿過胎盤和血腦屏障。因此，褪黑素對于治療缺血性腦卒中，促進神經保護可能具有潛在效力以及低毒性等特點。

以往研究[22～24]表明，缺血缺氧大鼠給予褪黑素治療，梗死體積顯著減少，具有細胞保護作用，并且大鼠神經行為測試得到改善。本文結果顯示，藥物組大鼠腦組織梗死體積較模型組減小，表明褪黑素能夠明顯減少缺血性腦卒中大鼠的腦梗死體積。本文結果還顯示，藥物組AI高于對照組，但少于模型組，表明褪黑素可保護缺血性腦卒中大鼠神經細胞免于凋亡。然而，褪黑素治療的最佳時機尚待確定，這需要以后進一步的深入探討。文獻[8,9]報道，缺血可以刺激腦組織內源性NSCs的增殖，但是活化的NSCs不能分化成為損傷區皮層成熟的神經元；在分化過程可能因凋亡而失去成熟的機會[25]。本文結果顯示，藥物組DCX/BrdU雙標陽性神經元前體細胞多于模型組，表明褪黑素能夠促進護缺血性腦卒中大鼠內源性神經元前體細胞發生。本文結果還顯示，藥物組NeuN/BrdU雙標陽性新生成熟神經元多于模型組，表明褪黑素能夠促進護缺血性腦卒中大鼠內源性新生神經元細胞的成熟。

總之，褪黑素能減少缺血性腦卒中大鼠神經細胞凋亡及減少腦梗死體積，同時又能夠促進內源性的神經元分化，并促進新生神經元的成熟，從而促進了大鼠缺血性腦卒中的腦損傷修復。