家蠶胚胎滯育的生理生化研究概述

解鴻青，李曉童，沈張飛，朗明紫，陳亞潔，李建琴，占鵬飛，費建明，時連根＊

（1.浙江大學動物科學學院，浙江杭州 310058；2.湖州市農業科學研究院，浙江湖州 313000）

滯育（diapause）是指昆蟲在個體發育的某個特定階段主動停止發育的現象，它不僅顯著提高了昆蟲抗逆性，使自身的生活周期與取得食物的季節變化相一致，從而有利于昆蟲個體度過環境惡劣的季節，而且促使種群內不同個體發育整齊，有利于交配繁衍后代，所以滯育是昆蟲一種重要的生存策略［1］。家蠶（Bombyx mori）滯育發生于胚胎發育早期，是典型的卵滯育昆蟲。每代都發生滯育的為一化性（univoltine），每代均不發生滯育的為多化性（polyvoltine），介于兩者之間，高溫（25℃）明催青時發生滯育，低溫（15℃）暗催青時不發生滯育的為二化性（bivoltine）［2，3］。大量研究表明，蛹期由咽下神經節（SG）合成和分泌的大量滯育激素（d H）作用于卵巢，決定了產下的蠶卵滯育［4］。滯育性卵產下后經過滯育發動就成為滯育卵，即時浸酸處理可阻止滯育發動。滯育蠶卵在25℃中可長期維持滯育狀態，經歷秋冬季自然低溫或長期人工低溫處理可解除滯育［5］。長期以來，國內外學者對家蠶胚胎滯育的生理生化變化進行了系統研究，取得了積極進展，本文對此研究概況進行了闡述。

1 家蠶滯育卵的H2O2處于低水平

H2O2是生物體內常見的一種活性氧分子，自由基生物學研究結果表明，其主要由呼吸電子傳遞滲漏和相關酶催化的氧化還原反應所產生，并被過氧化氫酶（Catalase，CAT）催化所清除［6］。已知H2O2可以通過細胞信號傳導途徑和修飾轉錄因子來調節細胞代謝和基因表達，細胞的分裂、增殖需要高水平的H2O2，但過高水平的H2O2卻會誘導細胞凋亡或殺死細胞［7］。近年來研究家蠶H2O2代謝與滯育的關系，發現在滯育發動階段，蠶卵H2O2處于低水平，負責清除H2O2的CAT活性急劇升高，并在產后4 d達到峰值［8］；在蠶卵產下后24 h，用外源H2O2處理以提高蠶卵內H2O2水平，可以有效阻止蠶卵的滯育發動，使蠶卵不再進入滯育［9］；如果先用CAT專一性抑制劑3-氨基三唑（3-amino-1，2，4-triafol，AT）處理蠶卵，以降低蠶卵CAT活性后，再用H2O2處理，則可顯著提高阻止蠶卵滯育發動的有效性［10］；經過H2O2處理的蠶卵，將進入一種特殊狀態的滯育，這種滯育卵可以隨時被HCI處理而解除滯育，用H2O2和HCI的混合液解除滯育的效果更好［11］。在即時浸酸阻止滯育發動時，蠶卵CAT活性受到極顯著的抑制，只有對照組的1/5，而H2O2水平升高2～3倍，略高于同期非滯育卵，從而阻止滯育發動，使蠶卵胚胎向前發育達到孵化［12］。滯育卵產后4 d，胚胎細胞停止分裂，胚胎進入滯育維持階段，CAT活性迅速下降后處于低水平，H2O2維持于低水平。解除了滯育的蠶卵在催青期用水處理，則孵化率顯著下降，但在水中添加H2O2，可以顯著提高水處理蠶卵的孵化率［13］。5℃冷藏處理滯育蠶卵，蠶卵H2O2水平在初期有一小幅降低后逐漸升高，在第50 d（滯育解除）達峰值［14］。已解除滯育的二化性蠶卵分別用25℃明催青和15℃暗催青，蠶卵體內H2O2水平在25℃明催青中后期呈U型變化，CAT活性在催青后期迅速上升，但蠶卵體內H2O2水平在15℃暗催青第16 d出現峰值，CAT活性在催青后期緩慢上升；幼蟲體內H2O2水平，兩種催青處理的基本相似，均是隨齡期增加而逐步下降，CAT活性在1～4齡逐步下降，而在5齡期有所回升；蛹體內H2O2水平，25℃明催青的分別在第2 d和第9 d出現峰值，CAT活性分別在第3 d和第6 d出現峰值，而15℃暗催的在第4 d出現峰值，CAT活性在第5 d出現峰值［15］。由此可見，H2O2水平在家蠶胚胎滯育的誘導、阻止和解除中發揮著重要的調節作用。

2 家蠶滯育卵中山梨醇大量積累

山梨醇是一種小分子糖醇，在蠶卵中大量積累可促進胚胎滯育。滯育蠶卵中山梨醇水平，在滯育發動階段逐步提高，在滯育維持階段升高并保持于很高水平，在滯育解除階段前期仍保持于很高水平，后期則迅速下降；即時浸酸后在短暫升高后迅速下降，滯育發動被阻止［16］。山梨醇在非滯育卵中不被合成，也不累積，因此是滯育專一的物質。但將非滯育蠶卵置于N2中，出現山梨醇大量積累和胚胎細胞分裂停止這類似于滯育的現象，但一旦再轉入新鮮空氣中，山梨醇水平迅速下降，胚胎細胞分裂迅速恢復［17］。Horie等（2000）研究發現，將脫殼滯育蠶卵放入Grace液中培養時，其滯育被解除，并能正常發育成蟻蠶，但在Grace液中大量添加山梨醇時，脫殼滯育蠶卵和非滯育蠶卵的胚胎發育均受阻，認為滯育蠶卵中大量積累的山梨醇抑制了胚胎發育，脫殼后培養于Grace液中時，由于山梨醇被稀釋而失去抑制作用［18］。山梨醇大量積累不僅促進家蠶胚胎滯育，還可以降低蠶卵自由水含量，從而降低蠶卵過冷點并保護細胞膜與生物大分子，這有利于滯育蠶卵越冬。滯育蠶卵中大約含有150 mmol/L山梨醇，可降低過冷點0.342℃，可見山梨醇積累對蠶卵越冬具有重要意義。

3 家蠶滯育卵中缺乏葡萄糖

蠶卵產下后約1 d形成卵黃細胞，卵黃細胞分解糖原產生葡萄糖。卵黃細胞中葡萄糖可在NAd P-多元醇脫氫酶催化下被NAd PH還原成山梨醇，山梨醇又可在NAd-山梨醇脫氫酶（sorbitol d ehyd rogenase，Sd H）催化下脫氫生成果糖和NAd H，果糖可進一步轉化為葡萄糖后重新用于糖原合成或者進入糖酵解。非滯育蠶卵中Sd H基因高效表達，所以非滯育蠶卵中不積累山梨醇，卵黃細胞分解產生的葡萄糖除部分用于卵黃細胞自身代謝外，大部分源源不斷地運輸到胚胎細胞，保證胚胎發育順利進行［19］。而滯育蠶卵中Sd H基因不表達，生成的山梨醇大量積累，同時葡萄糖被持續消耗，使卵黃細胞一方面提高糖原磷酸化酶活性以加強糖原降解，另一方面大大減少了葡萄糖外運，從而造成胚胎細胞因為葡萄糖缺乏而呼吸作用顯著下降，細胞分裂增殖停止，促使胚胎進入滯育［20］。滯育蠶卵即時浸酸后12 h，Sd H開始表達，約1 d后山梨醇水平顯著下降，葡萄糖水平上升，滯育發動被阻止；5℃低溫冷藏處理滯育蠶卵，在第40 d Sd H基因開始表達，山梨醇水平下降，葡萄糖供應恢復，胚胎細胞呼吸作用恢復正常，滯育狀態被解除［21］。將非滯育蠶卵置于N2中時，由于NAd H不能再生為NAd+，山梨醇脫氫反應被阻止，山梨醇大量積累，葡萄糖供應停止，從而造成胚胎發育停止；此時再將卵轉入空氣中，隨著O2供應恢復，NAd H再生為NAd+，山梨醇脫氫反應正常進行，山梨醇水平顯著下降，葡萄糖供應恢復，胚胎發育又正常進行［17］。由此可見，滯育蠶卵由于山梨醇大量積累而競爭性地造成葡萄糖缺乏，最終導致家蠶胚胎滯育。

4 家蠶滯育卵的呼吸耗氧量下降

呼吸作用處于新陳代謝的中樞，一方面提供了各種生命活動所需能量，另一方面提供了生物合成所需底物和還原力。呼吸作用持續處于極低水平時，細胞代謝和分裂增殖將受到抑制。非滯育蠶卵自產下至孵化，呼吸耗氧量逐步升高；滯育蠶卵在產下約1 d開始滯育發動時，呼吸耗氧量突然急劇下降，產下3 d時的呼吸耗氧量下降到產下1 d時的1/6，相當于非滯育卵產下3 d時的1/10，產下4 d時的呼吸耗氧量進一步下降后維持于極低水平，胚胎細胞停止分裂而進入滯育維持階段；滯育蠶卵在長期低溫處理以解除滯育的過程中，呼吸耗氧量保持于極低水平，到滯育解除時迅速上升［22］。Sonobe等（1991）研究滯育蠶卵呼吸耗氧量下降的原因，發現滯育性蠶卵卵殼的O2透過性顯著低于非滯育性蠶卵，但是滯育蠶卵卵殼O2透過量遠遠超過呼吸作用對O2的需要量，并且滯育發動前后和滯育解除前后都未見卵殼O2透過性發生顯著變化，即滯育蠶卵呼吸耗氧量下降并不是卵殼阻止外界O2進入而造成的［23］。柳沼利信等（1997）認為滯育蠶卵呼吸耗氧量下降的原因可能在于蠶卵內部代謝［24］，王啟龍等（2013）研究發現NAd＋降解增強和NAd＋再生下降是共同導致滯育蠶卵呼吸耗氧量下降的因素之一［25］。呼吸耗氧量的降低或升高，決定著蠶卵進入或解除滯育，但有關滯育性蠶卵呼吸耗氧量下降與提高的原因，還需要通過對滯育性蠶卵不同發育階段呼吸作用相關酶活性的系統檢測與分析，才能得出全面、完整的結論。