帶魚腸道中芽孢桿菌的分離鑒定及其發酵液抗菌性質研究

許本宏，林俊芳，葉志偉，郭麗瓊，陸雅琴，林金德

(華南農業大學 食品學院，食品生物技術研究所，廣東省微生態制劑工程技術研究中心，廣東 廣州 510640)

近年來，我國的水產養殖業得到了迅速發展，養殖規模日益擴大。但過度依賴提高養殖密度和過量投餌的養殖方式使得養殖業出現較多嚴重問題，如養殖動物的排泄物、殘餌及死亡殘體等對水質的污染,使得有害藻類及病菌大量繁殖，從而導致養殖水域生態環境日益惡化，各種水產動物疾病爆發，甚至出現水產動物大面積的死亡，給整個水產養殖業造成了巨大的經濟損失，嚴重制約了我國水產養殖業的健康發展[1-2]。目前，抗生素和化學藥物在解決這一問題上發揮著重要作用。然而，抗生素和化學藥物只能暫時抑制病害的發生，而且會產生耐藥菌株、藥物殘留、破壞養殖環境的微生態平衡和降低養殖動物的免疫力等問題[3]。因此研究開發高效、廣譜、安全的新型水產養殖用抗生素替代品具有重要意義。

益生菌是一類對宿主有益的活性微生物，具有促進宿主營養物質的消化吸收、調節宿主腸道菌群平衡、提高機體免疫能力和避免耐藥性菌株的產生等優點，被廣泛應用于食品、畜牧和水產等領域[4]。芽孢桿菌(Bacillus)被公認是一種有發展前景的應用于水產養殖的益生菌，有穩定性高(耐高溫、耐酸堿、耐干燥)、易加工、能分泌產生多種酶類(如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等)、營養代謝物質、多種抗菌活性物質以及可作為一種水質調節器，凈化養殖水環境等優點[5-8]，使其有望在水產養殖中逐步替代抗生素的使用。

本研究從帶魚腸道中分離到1株菌株JFL15，通過形態特征、生理生化特征、16S rDNA序列分析及系統發育樹的構建，初步鑒定為暹羅芽孢桿菌(B.siamensis)。本研究采用牛津杯法對15種水產常見病原菌進行抑菌效果試驗。此外，對菌株的發酵上清液的性質進行相關研究，發現其發酵產物性質穩定，適合開發成微生物制劑應用于水產養殖業。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試動物及菌種

帶魚(Trichiurushaumela)購自廣東省廣州市某市場，約1～2 kg。

指示菌：嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)4001、美人魚發光桿菌(Photobacteriumdamsela)4002、哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)4003、溶藻弧菌(V.alginolyticus)4004，由中山大學惠贈；嗜水氣單胞菌(5101、5102、5103)、大腸桿菌(Escherichiacoli)5105、遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)5111、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)5112、溶藻弧菌(V.alginolyticus)5201、哈維氏弧菌(V.harveyi)5203、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)5205、創傷弧菌(V.vulnificus)5206、查氏弧菌(V.chagasii)5209由海南大學海洋學院提供。

1.1.2 培養基

細菌基礎培養基(1 L)：胰蛋白胨10 g，酵母提取粉5 g，NaCl 5 g，pH 7.27.4。

MSM培養基(1 L)：蔗糖20 g，NH4NO32 g，KH2PO43 g，Na2HPO410 g，MgSO40.2 g，酵母膏0.2 g，CaCl20.7 μg，MnSO41 μg。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離和純化

采用平板稀釋法，取帶魚腸道內含物于10 mL無菌的蒸餾水中，制備懸濁液，分別梯度稀釋獲得濃度為10-7、10-8、10-9的樣品溶液，移取0.1 mL樣品溶液涂布于固體初篩培養基(細菌基礎培養基)平板上，37 ℃培養24 h。挑取單菌落反復劃線純化2～3次，4 ℃冰箱保藏、備用。

1.2.2 篩選菌株的鑒定

1.2.2.1 生理生化鑒定

參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[9]和《常見細菌系統鑒定手冊》[10]中的試驗方法，對菌株形態及生理生化特性進行鑒定。

1.2.2.2 16S rDNA序列測定

提取菌株的基因組總DNA。16S rDNA的克隆采用細菌的通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1495R(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)進行PCR擴增。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，樣品經切膠回收后送深圳華大基因有限公司進行測序。將測序的16S rDNA基因序列與GeneBank中已知的核酸序列進行Blast分析，同源性較高的序列，用4.1軟件進行分子系統學分析并構建系統發育樹。

1.2.3 菌株JFL15發酵上清液的性質研究

以哈維氏弧菌[11-12]4003為指示菌，采用牛津杯法測定上清液的抑菌活性，將指示菌與冷卻至50 ℃的細菌基礎培養基混勻倒平板，培養皿內放置直徑為6 mm的無菌牛津杯，向牛津杯中加入150 μL上清液，置于37 ℃培養箱中培養12 h，測量抑菌圈直徑(mm)。以孔中加入空白培養液為對照，每個處理重復3次。分別考察發酵上清液對酶、溫度、pH、紫外線耐受性以及儲存穩定性[13]，以初步判斷菌株JFL15產生的抗菌活性物質的穩定性。

1.2.3.1 酶對發酵上清液抑菌活性的影響

將發酵上清液分別用終質量濃度為1 mg/mL 的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、脂肪酶37 ℃中水浴1 h，以未經酶處理的發酵上清液為對照，測定抑菌活性，每個處理重復3次。

1.2.3.2 溫度對發酵上清液抑菌活性的影響

將發酵上清液分別置于40、60、80、100 ℃處理30 min，另取一份121 ℃高壓滅菌30 min，待冷卻至室溫后，過濾除菌，以未經溫度處理的發酵上清液作為對照，測定抑菌活性，每個處理重復3次。

1.2.3.3 pH對發酵上清液抑菌活性的影響

將發酵上清液分別用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH分別調節pH為1、3、5、7、9、11，室溫處理2 h，再將pH調回7.0，過濾除菌，以未經處理的發酵上清液作為對照，測定抑菌活性，每個處理重復3次。

1.2.3.4 紫外線對發酵上清液抑菌活性的影響

將發酵上清液置于無菌培養皿中，在超凈臺紫外燈下(功率20 W輻照強度， 樣品與光源距離40 cm)分別照射15 min、30 min、45 min、1 h、2 h、3 h，過濾除菌，以未經處理的發酵上清液作為對照，測定抑菌活性，每個處理重復3次。

1.2.3.5 儲存時間對發酵上清液抑菌活性的影響

將發酵上清液置于4 ℃冰箱里分別儲存1、7、14、21、28 d，以新鮮發酵上清液為對照，測定抑菌活性，每個處理重復3次。

1.2.4 菌株JFL15發酵上清液的抗菌譜測定

以嗜水氣單胞菌、美人魚發光桿菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌、大腸桿菌、遲鈍愛德華氏菌、銅綠假單胞菌、副溶血弧菌、創傷弧菌、查氏弧菌15株水產常見病原菌為指示菌，采用牛津杯法測定上清液的抗菌譜，具體操作同1.2.3。

1.3 數據分析

試驗數據采用SPSS 17.0 軟件進行單因素方差分析，顯著性分析采用Turkey和Duncan檢驗法進行多重比較，顯著性水平設為P<0.05，數據以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌株的分離與篩選

通過對帶魚腸道內含物中微生物的分離篩選，共獲得30株細菌菌株，其中有7株為芽孢桿菌。經過3次MSM培養基液體發酵培養，測定其發酵液的抑菌活性，最終選定一株抗菌活性強的菌株，命名為JFL15。

2.2 菌株JFL15的鑒定

2.2.1 形態特征

菌株JFL15在LB固體培養基上培養，菌落為圓形，乳白色，邊緣不規則，表面皺褶，邊緣翹起，中間內陷，不透明，干燥；液體培養后4 ℃靜止放置時有菌膜形成。革蘭氏染色陽性，呈桿狀(圖1)。

圖1 菌株JFL15的菌落形態(左)和革蘭氏染色(右)

2.2.2 生理生化特征

菌株JFL15生理生化特征檢測結果顯示，該菌株能利用葡萄糖、蔗糖、淀粉、山梨醇、甘露醇等多種碳水化合物作為唯一碳源進行生長，能利用硫酸銨、草酸銨、酪氨酸、組氨酸等多種無機或有機氮作為唯一氮源進行生長，能水解淀粉和明膠，分別能在45 ℃、pH 58、7.5% NaCl環境下生長，主要生理生化特性見表1。

表1 菌株JFL15的生理生化特征

注：“+”：陽性；“-”：陰性；“V”：不明顯.

2.2.3 16S rDNA序列測定及系統發育學分析

菌株JFL15 16S rDNA基因序列測序結果表明，其大小為1538 bp。將測序獲得的序列在NCBI上進行核苷酸同源性比對，結果顯示，其與解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)、暹羅芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)的16S rDNA核苷酸序列同源性最高，均在97.5%以上。采用鄰接法構建系統發育樹，結果(圖 2)顯示，菌株JFL15與暹羅芽孢桿菌在同一分支，親緣關系最近。結合形態學和生理生化特征，初步確定菌株JFL15為暹羅芽孢桿菌。

2.3 暹羅芽孢桿菌JFL15發酵上清液的理化性質研究

2.3.1 對酶的穩定性

暹羅芽孢桿菌JFL15的發酵上清液經各種蛋白酶和脂肪酶處理1 h后，其抑菌活性(抑菌圈直徑大小)有少許下降，但能保持86.8%的抑菌活性(圖3)。說明暹羅芽孢桿菌JFL15的發酵上清液中的抗菌活性物質對酶不敏感，同時說明發酵上清液中的抗菌活性物質中蛋白質的成分很少，主要成分可能為性質穩定的脂肽類化合物。

2.3.2 對熱的穩定性

暹羅芽孢桿菌JFL15的發酵上清液分別經40、60、80、100 ℃和121 ℃處理30 min后，活性隨著溫度的升高呈現緩慢下降的趨勢，結果見圖4。在100 ℃下處理30 min，抑菌活性還能保持75.1%，而121 ℃高壓滅菌30 min后發酵液完全失活，這可能是由于溫度100 ℃時暹羅芽孢桿菌JFL15的發酵上清液中抗菌活性物質的結構遭到破壞從而失去活性，但溫度低于100 ℃時發酵液具有較好的熱穩定性。說明暹羅芽孢桿菌JFL15的抗菌活性物質具有較強的熱穩定性。

2.3.3 對酸堿的穩定性

暹羅芽孢桿菌JFL15的發酵上清液經不同pH處理后，pH 7時，暹羅芽孢桿菌JFL15的發酵上清液的抗菌活性最強。這是因為暹羅芽孢桿菌JFL15的發酵液的初始pH為7.4，所以在pH 7下處理2 h對其抑菌活性造成影響。在pH低于或高于7時，發酵液活性明顯下降，但在pH 3～9范圍內，發酵液至少還能保持73.1%的活性。但當pH低于3或高于9時，發酵液抑菌活性顯著快速降低，在pH為1或11時，發酵液完全失去活性(圖5)。說明暹羅芽孢桿菌JFL15的發酵上清液對酸堿具有一定程度的耐受性。

2.3.4 對紫外線的穩定性

暹羅芽孢桿菌JFL15的發酵上清液在紫外線下照射15～120 min，其抗菌活性略有下降，保持85.3%的活性；120 min后隨著照射時間的延長抑菌活性明顯下降，照射180 min后還能保持62.4%的活性(圖6)。表明暹羅芽孢桿菌JFL15的發酵液中的抗菌活性物質對紫外線不敏感。

圖2 基于16S rDNA序列同源分析的系統進化樹

圖3 發酵上清液對酶的耐受性注：圖中不同字母表示抑菌活性達到顯著水平，下同.

圖4 發酵上清液對溫度的耐受性

圖5 發酵上清液對酸堿的耐受性

圖6 發酵上清液對紫外線的耐受性

2.3.5 儲存時間的影響

暹羅芽孢桿菌JFL15的發酵上清液置于4 ℃下儲存1、7、14、21、28 d后，其抑菌活性隨著儲存時間的增加呈現緩慢降低的趨勢。儲存時間在7 d內，發酵上清液的抑菌活性顯著降低，均保持在對照組的95%以上；而從儲存8 d開始，其抑菌活性下降較為明顯，但發酵液在儲存28 d后，活性不低于82.2%(圖7)。表明暹羅芽孢桿菌JFL15發酵液中的抗菌活性物質性質穩定，儲存28 d還能保持較高的抑菌活性，大大增加了其開發成微生物制劑應用于水產養殖業的價值。

2.4 暹羅芽孢桿菌JFL15發酵上清液的抗菌譜測定

測定了暹羅芽孢桿菌JFL15的發酵上清液對15株水產常見病原菌的抑菌活性，結果表明，暹羅芽孢桿菌JFL15的發酵上清液對嗜水氣單胞菌、美人魚發光桿菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌、大腸桿菌、遲鈍愛德華氏菌、銅綠假單胞菌、副溶血弧菌、創傷弧菌、查氏弧菌均有較強抑制活性(表2)，其中對美人魚發光桿菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌、嗜水氣單胞菌和遲鈍愛德華氏菌的抑菌效果尤為突出。說明暹羅芽孢桿菌JFL15對水產病原菌具有廣譜抑菌活性，其在水產動物疾病防治方面具有廣闊的應用前景。

圖7 儲存時間對發酵上清液抑菌活性的影響

表2 暹羅芽孢桿菌JFL15發酵上清液的抗菌譜

3 討 論

水產養殖生態環境的破壞和抗生素濫用引起耐藥性細菌出現是制約我國水產養殖業健康發展的主要因素，因此，尋找高效低毒、安全綠色的水產養殖用抗生素替代品在現階段顯得尤為重要。芽孢桿菌是一類好養產芽孢的革蘭氏陽性細菌，在自然界中分布廣泛，其中部分菌株已經成為應用廣泛的益生菌[14]。以芽孢桿菌作為抗生素替代品相對于乳酸菌和雙歧桿菌來說具有許多優勢：第一，穩定性好，具有耐高溫、耐酸堿、耐干燥等特點，可以滿足飼料加工和運輸、儲存過程中的要求。且芽孢一旦形成，便能耐受熱、壓力、紫外線、強酸、強堿、有機溶劑、真空干燥等各種不利環境[15]。第二，芽孢桿菌能產生多種酶[16](如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等)和營養物質(如氨基酸、維生素B、維生素C、維生素K等)，不僅能為水產動物提供營養，而且能提高水產動物的消化能力，從而促進養殖動物的生長。第三，芽孢桿菌能產生更多種抗菌活性物質，據報道，芽孢桿菌能產生細菌素[17-18]、肽類、酶類、抗菌蛋白類[19-20]、大環內酯類[21]、脂肽類[22]和聚酮類化合物[23]等多種抗菌活性物質。因此，芽孢桿菌能更有效的抑菌水產病原菌，提高水產動物的防病能力和免疫力。第四，菌種的來源是進行拮抗菌篩選的一個重要指標，直接關系到拮抗菌的應用效果。從宿主本身或者其生存環境中篩選到的拮抗菌的作用遠遠優于從異種或者完全不同的環境中分離到的拮抗菌；而且拮抗菌要發揮抗菌活性必須定殖到水產動物腸道的特定部位，這個過程中拮抗菌必須要耐受水產動物上消化道的各種不利環境[24]。因此，本試驗從帶魚腸道內分離篩選具有廣譜抗菌活性的芽孢桿菌，這樣篩出來的菌株才能更好的發揮益生作用。第五，芽孢桿菌不僅能產生抗菌活性物質抑制病原菌，而且能迅速降解和轉化養殖環境中的有機物，有效降低水體中的氨氮、亞硝酸鹽、硫化物等有害物質的含量，從而有效的改善水質，維持良好的生態環境[25]。

芽孢桿菌家族菌株種類繁多、數量龐大，對其進行分類鑒定非常復雜。傳統的芽孢桿菌的分類方法主要有經典分類法(表型特征)、分子分類法和化學分類法[26]?，F在的分類研究大多采用多相分類法，即將形態、生理生化、化學、分子等方法相結合，對其進行綜合分析，從而得出相對精確的分類結果。但由于芽孢桿菌種類繁多，不同種之間親緣關系非常接近，以至于在形態、生理生化特征、化學以及16S rDNA序列都非常相似，從而無法對其進行準確分類鑒定；甚至一些分類學家對某些已經鑒定完成的芽孢桿菌的分類地位仍存在爭議[27-28]。本研究中對菌株JFL15進行分類鑒定過程中發現，菌株JFL15在形態、生理生化特征及16S rDNA序列與解淀粉芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌、暹羅芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌都非常接近，雖然在構建系統發育進化樹中菌株JFL15與暹羅芽孢桿菌在同一分支，親緣關系最近，并結合形態學和生理生化特征，將其初步確定為暹羅芽孢桿菌；但實際上暹羅芽孢桿菌JFL15的16S rDNA序列與解淀粉芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌、暹羅芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌之間只有幾個(甚至個別)堿基的不同，而這少數幾個堿基的不同有可能是菌株在生長或基因測序過程中突變引起的，造成菌株分類鑒定出現偏差。因此，多相分類法在分類鑒定芽孢桿菌方面還存在一定的局限性。近年來，隨著基因組測序技術的飛速發展，大量代表性的模式生物基因組計劃和微生物基因組計劃相繼開展，截止目前，已經有超過1000株芽孢桿菌完成全基因組測序并將序列上傳至NCBI數據庫中?；诨蚪M和比較基因組序列分析逐漸成為判定微生物分類及親緣進化關系的一個常規方法。平均核苷酸同源性[29]是基于物種全基因組序列，通過比較基因組學分析不同物種之間同源基因序列來判定物種間的遺傳關聯性。平均核苷酸同源性的計算涉及大量的基因，與單基因(如16S rDNA、管家基因gyrB等)相比，具有全面性和精確性優點，可以彌補多相分類法在分類鑒定芽孢桿菌方面的局限性。對本試驗中篩選出來的暹羅芽孢桿菌JFL15進行了全基因組測序，并將序列上傳至NCBI數據庫中(登錄號：LFWQ00000000)。接下來將對菌株JFL15進行基于全基因組的平均核苷酸同源性分析，以期獲得更準確的分類地位。

本試驗中對暹羅芽孢桿菌JFL15的發酵上清液進行了性質研究，結果表明，發酵上清液中的抗菌活性物質對酶、溫度、酸堿度、紫外線都很穩定，并且在4 ℃下儲存28 d后還能保持較高的活性，說明暹羅芽孢桿菌JFL15產生的抗菌活性物質具有較強的穩定性和環境適應性。對暹羅芽孢桿菌JFL15的抗菌譜的測定發現，暹羅芽孢桿菌JFL15的發酵上清液對嗜水氣單胞菌、美人魚發光桿菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌、大腸桿菌、遲鈍愛德華氏菌、銅綠假單胞菌、副溶血弧菌、創傷弧菌、查氏弧菌均具有較強抑制活性，說明暹羅芽孢桿菌JFL15產生的抗菌活性物質具有廣譜抑菌活性。Liu等[30]對莫海威芽孢桿菌(B.mojavensis)J7和短小芽孢桿菌(B.pumilus)B16的發酵液進行抗菌活性測定，發現其對副溶血弧菌和創傷弧菌的抑菌活性較弱(抑菌圈直徑小于14 mm)。Nair等[31]對蠟樣芽胞桿菌(B.cereus)TC-2的發酵液進行抗弧菌研究，發現對哈維氏弧菌和副溶血弧菌的抑菌活性分別13 mm和12 mm。Thongjun等[32]對7株芽孢桿菌的抗菌物質進行粗提取，而粗提物對副溶血弧菌的抑菌圈小于14 mm。以上研究表明，不同種類的芽孢桿菌產抗菌活性物質的能力可能不同，且培養條件和提取方法對抗菌活性有較大影響。本研究中暹羅芽孢桿菌JFL15的發酵上清液在未進行任何培養條件優化和抗菌物質粗提取的條件下對15株水產常見病原菌的抑菌圈直徑最低為17 mm，說明暹羅芽孢桿菌JFL15具有高產抗菌活性物質和抗菌譜廣等優點。綜上所述，暹羅芽孢桿菌JFL15的這些突出特性有利于其被開發成微生物制劑，部分或者完全取代抗生素，廣泛應用于水產養殖領域，這將成為今后水產動物疾病防治方面的研究熱點。

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