農桿菌介導的甜高粱遺傳轉化研究進展

杜 浩， 莊義慶， 黃 萍，3， 杜道林，3

(1.江蘇大學環境與安全工程學院，江蘇鎮江 212013； 2.江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所，江蘇句容 212013； 3.江蘇大學農業工程研究院，江蘇鎮江 212013)

甜高粱[Sorghumbicolor(L.) Moench]最早起源于非洲，是粒用高粱的一個變種，其用途十分廣泛，其種子可以作為食物也可以飼用，其莖稈則是高質量的青貯飼料。此外，甜高粱莖干中豐富的糖汁可以用于制糖和生產乙醇，而剩下的莖渣又是優質的造紙原材料，因此甜高粱又有“高能作物”的美譽，受到越來越多學者的關注[1-4]。

然而，甜高粱的種質資源匱乏，加上傳統的有性雜交育種具有不親和、育種周期長等缺點，使得甜高粱的種植和使用受到了限制?，F代基因工程技術的發展，為甜高粱新品種的獲得提供了一種快速有效的途徑。Gao等認為，甜高粱是禾本科中最難進行組織培養和遺傳轉化的物種之一，獲得適應性和實用性都較強的新品種較為困難[5]。目前，已開展較多的高粱遺傳轉化研究對甜高粱的功能基因分析、創建T-DNA插入突變體等具有重要的理論借鑒價值。本文針對甜高粱遺傳轉化所必須考慮的幾個關鍵因素，就近些年來國內外的研究工作進行綜述，以期為甜高粱的遺傳轉化提供理論參考。

1 甜高粱基因型及外植體的選擇

與基因槍介導的遺傳轉化不同，農桿菌介導的甜高粱遺傳轉化受基因型的限制比較大，成功獲得遺傳轉化的甜高粱品種不多且轉化率較低。目前已報道的農桿菌介導法成功轉化的甜高粱基因型有二十幾種，而且不同基因型采用不同形式的受體材料，其轉化效率也各不相同(表1)。其中，研究最廣泛的是P898012、Tx430，轉化率分別可以達到33.0%、8.3%。

愈傷組織是農桿菌介導法中最常用的一種外植體。Raghuwanshi等對32種甜高粱進行愈傷組織的誘導增殖研究，發現Ramada、R9188及Wray較其他品種在愈傷組織誘導與再生方面具有較強的優勢，他們認為選擇合適的甜高粱基因型獲取愈傷組織是成功獲得甜高粱遺傳轉化的關鍵因素之一[1]。除愈傷組織外，在農桿菌介導的甜高粱遺傳轉化中，最常用的外植體有幼胚、莖尖分生組織及幼穗等(表1)。采用幼胚作為外植體時，理想大小為1.0～1.5 mm，時間為授粉后9～14 d[6-9]。Zhao等采用農桿菌介導法對甜高粱P898012的幼胚進行遺傳轉化，首次成功獲得甜高粱轉基因植株[6]。Carvalho等發現，相對于預培養后的幼胚或者來源于幼穗的愈傷組織，農桿菌對幼胚的侵染較容易，他們還發現受損傷的幼穗能夠抑制共培養中農桿菌的生長，不利于農桿菌的侵染[10]。除幼胚外，莖尖分生組織也是一種理想的外植體。劉宣雨等以芽頂端分生組織建立了甜高粱的高頻、高效立體培養再生體系[11]。Yellisetty等采用SPV462的莖尖為外植體獲得了34%～38%的轉化率[12]。

2 受試材料的預處理

對甜高粱品種在農桿菌浸染前后進行適當的處理，有助于提高其轉化效率。Carvalho等認為，來源于最佳生長條件下的幼胚在共培養后愈傷組織的形成狀態較好，而來源于水中或者干旱脅迫條件下的幼胚，在共培養階段會停止生長甚至死亡[10]。Zhao等發現，野外種植的甜高粱幼胚的轉化率在 7.4%～10.1%，而溫室收獲幼胚的轉化率在0.95%～2.17%[6]，這與Lu等的研究結果相反，后者認為采用來源于溫室的幼胚獲得的轉化率為1.4%，而野外獲得的幼胚轉化率僅為0.7%[7]。盡管對外植體的來源能否提高甜高粱轉化率還存在爭議，但可以認為外植體的來源也是影響轉化率的一個重要因素。

Nguyen等發現，用4 ℃低溫對甜高粱品種Sensako 85/1191 幼胚預處理1 d， 外植體的成活率及愈傷組織的形成

表1 用于轉基因研究的不同品種甜高粱的遺傳轉化系統

注：bar表示雙丙氨膦抗性，gfp表示綠色熒光蛋白，gus表示β-葡萄糖苷酸酶，hpt表示潮霉素磷酸轉移酶，nptⅡ表示新霉素磷酸轉移酶，manA表示磷酸甘露糖異構酶，DsRed表示紅色熒光蛋白，yfp表示黃色熒光蛋白。

效果最佳，還可以有效降低培養基的更換頻率[8]。而Gurel等發現，將甜高粱品種P898012的幼穗在4 ℃放置0～5 d，放置5 d的甜高粱幼穗GFP表達率僅為放置0 d的28.4%[9]。如果在農桿菌浸染前對幼胚進行加熱處理會有助于提高GFP表達率，最佳處理條件為43 ℃預處理3 min，然后冷卻至室溫(25 ℃)并且不對愈傷組織進行離心處理，可獲得GFP最高表達率，為49.1%，穩定轉化率為8.3%。Gurel等接種前將幼胚在液體培養基上進行培養，使得GFP的表達率是在水中培養的2.67倍[9]。

3 培養基的成分

研究者對甜高粱培養基成分的改良主要集中在以下幾個方面：(1)減少酚類物質產生。主要措施有選擇培養基類型、更換培養基，以及添加椰子汁、聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)、抗氧化劑(半胱氨酸和雙對氯苯基三氯乙烷等)、活性炭。(2)提高愈傷組織的質量。主要措施是添加銅離子及激素。(3)添加乙酰丁香酮。

Raghuwanshi等發現，與DBC1、M11培養基相比，mM11培養基能夠獲得90%左右的胚性愈傷誘導率，顯著提高了愈傷組織的形成率[1]。Zhao等認為，良好的愈傷組織是成功獲得甜高粱遺傳轉化體的關鍵，通過對MS、N6培養基的比較研究發現，甜高粱在MS培養基上比在N6培養基上形成的愈傷組織更好且產生的酚類物質更少，此外，他們認為在培養基中添加椰子汁能有效抑制酚類物質的產生[6]，這與Carvalho等的研究結果[10]相似，他們認為在共培養基中添加椰子汁能提高幼胚的成活率和轉化效率。而Nguyen等卻認為，添加椰子汁并未提高轉化效率，同時他們在培養基中添加脯氨酸、脫落酸也并沒有產生額外的正面效應[8]，這與Elkonin等的研究結果[13]并不一致。Gao等認為，農桿菌會產生使愈傷組織壞死的物質，研究發現添加1% PVPP或者頻換地更換培養基將有助于減少酚類物質的產生，促進新鮮愈傷組織的生長[5-6]。Lu等發現，PVPP較聚乙烯吡咯烷酮(PVP)對愈傷組織的壞死和褐化具有更好的效果[7]，但Carvalho等則認為，雖然培養基中添加PVPP可以減輕愈傷組織的褐化程度，卻不能降低幼胚的死亡率[10]?；钚蕴烤哂休^強的吸附性能，Nguyen等在培養基中添加活性炭發現，活性炭能有效減少黑色物質的形成，顯著提高外植體的存活率，然而活性炭的添加會吸附培養基中的2，4-D等活性成分，從而降低幼胚的愈傷誘導率[8]。

Lu等在共培養基中添加抗氧化劑半胱氨酸和雙對氯苯基三氯乙烷(DDT)發現，遺傳轉化率會顯著降低[7]。而Pandey的研究則表明，共培養基中添加半胱氨酸，GUS瞬時表達率最高，外植體的壞死率也會降低[14]。以上研究結果說明，半胱氨酸對轉基因效率的影響在不同甜高粱品種之間并不相同。Wu等在共培養基中添加低濃度的銅離子并且在篩選培養基中添加一定量的芐氨基腺嘌呤(BAP)，發現對提高甜高粱遺傳轉化的質量、生長速度及轉基因愈傷組織的再生率都有很大的促進作用[15]。

此外，外源添加乙酰丁香酮是影響甜高粱遺傳轉化的關鍵因素之一。植物受到損傷后會產生酚類物質，乙酰丁香酮是雙子葉植物受傷后產生的主要酚類化合物之一，這些物質會透過農桿菌的細胞膜活化和誘導VirA、VirG及其他Vir區基因的表達，從而將外源基因整合到植物的基因組中。而甜高粱缺少VIR介導化合物，這會降低農桿菌的遺傳轉化率。Gao等在農桿菌介導甜高粱遺傳轉化的研究中，添加了 100 μmol/L 乙酰丁香酮，獲得了較高的轉化效率[5-6]。Jambagi等研究則表明，200 μmol/L乙酰丁香酮可以獲得最佳的轉化效率[16-17]。這說明乙酰丁香酮在不同甜高粱品種的遺傳轉化中的最佳作用濃度并不相同，具體需要根據甜高粱的基因型和農桿菌的菌種來確定[18]。

4 篩選體系的選擇

理想的篩選體系是在盡可能完全快速地將未轉化的細胞或植株抑制或者殺死的同時盡可能多地保留轉化植株，因此篩選體系的選擇對甜高粱的遺傳轉化具有重要影響。篩選過程一般在甜高粱的再生階段進行，也可以在植株開始分化后一段時間或者在轉化后進行[19]。目前用于甜高粱遺傳轉化的篩選體系主要有正向篩選體系和負向篩選體系。早在1987年，就有研究者將bar基因用于抗除草劑篩選基因篩選系統中，bar基因的表達能使轉基因植株產生對草胺膦(PPT)、雙丙氨磷(bialaphos)、草丁膦(basta)等草甘膦類除草劑的抗性，這一類除草劑會阻斷未轉化植株的胺代謝途徑，毒害其生長。在抗生素篩選體系中，主要應用hpt和nptⅡ基因，這2種基因編碼氨基磷酸轉移酶，使轉化植株產生對卡那霉素、新霉素、巴龍霉素、潮霉素及G418等氨基糖苷類抗生素的抗性。篩選劑的濃度和篩選周期的選擇對遺傳轉化的影響較大，Lu等研究認為，高濃度的篩選劑PPT(5 mg/L或者 10 mg/L)會產生酚類物質而使幼胚褐化，以及抑制轉基因植株的再生，他們采用低濃度的篩選劑(2.5 mg/L PPT)配合較短的篩選周期(4～8周)，并且在生芽培養基中去除篩選劑，獲得了較高的陽性愈傷組織成活率[7]。

從表1中可以看出，在甜高粱遺傳轉化中廣泛采用負向篩選系統。然而，Gao等研究認為，bar基因雖然在篩選轉基因植株中具有較大的優勢，但它可以通過甜高粱與其野生近緣種的天然雜交而逃逸到環境中，產生抗除草劑的“超級雜草”[20]。因此，近年來人們把目光轉向正向篩選體系，目前應用最為廣泛的正向篩選體系是磷酸甘露糖異構酶系統(PMI)。正向篩選系統不僅可以降低環境風險，而且可以避免使用酚類物質，從而有助于提高轉化率[20-22]。在正向篩選系統中，以能編碼磷酸甘露糖異構酶的manA基因為篩選基因，它能將6-磷酸甘露糖轉化為6-磷酸果糖，使本來不能被植物利用的甘露糖能夠轉化為植株所能利用的物質。當以甘露糖作為篩選劑時，轉化細胞能夠以甘露糖作為碳源正常生長，而未轉化細胞則由于沒有可以利用的碳源停止生長[23]。

報告基因常被用來指示遺傳轉化的目的基因是否得到表達，然而，利用GUS作為一個報告系統的最大缺點是它需要一個破壞性的試驗，妨礙了所鑒定的轉化組織的進一步增殖和再生[24]。在轉基因植株的早期檢測過程中，GFP系統要優于GUS系統[15]。此外，Wu等也將DsRed(編碼紅色熒光蛋白)和YFP(編碼黃色熒光蛋白)用于農桿菌介導的高粱轉化研究中[15]。

5 農桿菌菌株的選擇及轉基因品種改良

通常用于植物遺傳轉化的農桿菌菌株有農桿堿型(琥珀堿型)、胭脂堿型、章魚堿型3大類，其代表菌株分別為EHA101/EHA105、C58、LBA4404[21]。已報道的成功用于單子葉植物的菌株主要有LBA4404、C58、EHA101、EHA105、AGL0和AGL1[22]。從表1中可以看出，在甜高粱遺傳轉化體系中，最常用的菌種有EHA和LBA4404菌株。Pandey研究表明，EHA105比LBA4404和AGL1的瞬時表達率高，農桿菌EHA105對植物基因型依賴性較小，能有較高的GFP瞬時表達率[14]。而Wu等研究表明，AGL1與LBA4404相比，能夠獲得更高的轉化效率，但LBA4404完整的單拷貝插入而沒有質粒骨架的比例為96.4%，而AGL1為73.9%[15]。

近年來，科學家們通過農桿菌介導的植物遺傳轉化方法將不同來源、不同功能的基因導入甜高粱，成功獲得了一批抗蟲、抗病、抗逆，抗除草劑的多產、優質甜高粱品種，為新能源的開發利用作出了重大貢獻。甜高粱所含人體所必需的氨基酸尤其是賴氨酸含量極低，容易引起兒童營養不良。Zhao等將富賴氨酸HT12基因轉入甜高粱品種P898012和PHI391中，并成功獲得含賴氨酸的高粱[28]。Lu等則將賴氨酸tRNA合成酶基因轉入甜高粱品種P898012中，并提高了籽粒中賴氨酸的含量[10]。這些研究成果為世界尤其是非洲、亞洲地區以甜高粱為主食的國家帶來了福音。

病蟲害是影響作物提高產量和產率的關鍵因素，Savarimuthu等將能夠編碼殺蟲蛋白的基因轉入甜高粱中，可達到不使用除草劑就能殺死病蟲的目的[24]。近年來，科學家們將殺蟲晶體蛋白基因cry1Ab、Cry1C轉入甜高粱中，在抗玉米螟和大螟方面取得了巨大進展[24，29-31]。在抗旱性研究方面，Gao等[5]和Yellisetty等[9]分別將編碼索馬甜蛋白的目的基因tlp和編碼海藻糖-6-磷酸的TSP基因轉入甜高粱中，獲得了抗旱的甜高粱新品種。

6 展望

農桿菌介導的植物遺傳轉化法具有較高的轉化效率，能夠以單拷貝或者2～3拷貝穩定地轉化到植物基因組中，并且能夠穩定地遺傳給后代[5-6，15，29，32]。盡管農桿菌介導的甜高粱遺傳轉化已經取得了較大的進展，但仍然面臨一些亟待解決的問題：(1)農桿菌介導法對甜高粱的基因型及外植體類型要求較高；(2)酚類物質的產生對甜高粱外植體的毒害作用，不利于植株的再生；(3)缺乏較為成熟穩定的遺傳轉化體系；(4)重要農藝性狀基因方面的研究緩慢，且轉基因甜高粱的田間種植及推廣還存在阻礙。至今尚未有甜高粱轉基因植株的田間種植的正式報道。

今后對甜高粱遺傳轉化的研究可以集中在以下幾個方面：(1)對轉化體系中的參數進行優化，如外植體的類型、農桿菌菌株、共培養時間及篩選體系的優化等；(2)提高甜高粱的多抗性和營養品質改良，研究可以在后代分離標記基因的轉基因體系，提高轉基因植物的安全性；(3)發展應用分子標記、基因工程及分子設計等新元件和新技術，并與常規育種有機結合，加速新種質和品種的培育[26]；(4)利用特殊的地理位置，在一些沿海灘涂及鹽堿地規范化種植甜高粱品種，為甜高粱的應用推廣打下基礎。

[1]Raghuwanshi A，Birch R G. Genetic transformation of sweet sorghum[J]. Plant Cell Reports，2010，29(9)：997-1005.

[2]Zheng L Y，Guo X S，He B，et al. Genome-wide patterns of genetic variation in sweet and grain sorghum (Sorghumbicolor)[J]. Genome Biology，2011，12(11)：R114.

[3]Li M，Feng S，Wu L，et al. Sugar-rich sweet sorghum is distinctively affected by wall polymer features for biomass digestibility and ethanol fermentation in bagasse[J]. Bioresource Technology，2014，167(3)：14-23.

[4]Olweny C，Jamoza J，Dida M M，et al. High genetic diversity for improvement of sweet sorghum [Sorghumbicolor(L.) Moench] genotypes for sugar and allied products[J]. Molecular Plant Breeding，2014，5(6)：29-35.

[5]Gao Z，Jayaraj J，Muthukrishnan S，et al. Efficient genetic transformation ofSorghumusing a visual screening marker[J]. Genome，2005，48(2)：321-333.

[6]Zhao Z Y，Cai T，Tagliani L，et al. Agrobacterium-mediated sorghum transformation[J]. Plant Molecular Biology，2000，44(6)：789-798.

[7]Lu L，Wu X R，Yin X Y，et al. Development of marker-free transgenic sorghum[Sorghumbicolor(L.) Moench]using standard binary vectors with bar as a selectable marker[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2009，99(1)：97-108.

[8]Nguyen T V，Thanh Thu T，Claeys M，et al. Agrobacterium-mediated transformation of sorghum [Sorghumbicolor(L.) Moench] using an improved in vitro regeneration system[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2007，91(2)：155-164.

[9]Gurel S，Gurel E，Kaur R，et al. Efficient，reproducibleAgrobacterium-mediated transformation of sorghum using heat treatment of immature embryos[J]. Plant Cell Reports，2009，28(3)：429-444.

[10]Carvalho C H S，Zehr U B，Gunaratna N S，et al. Agrobacterium-mediated transformation of sorghum：factors that affect transformation efficiency[J]. Genetics and Molecular Biology，2004，27(2)：259-269.

[11]劉宣雨，劉樹君，宋松泉. 建立甜高粱(Sorghumbicolor)高頻、高效再生體系的研究[J]. 中國農業科學，2010，43(23)：4963-4969.

[12]Yellisetty V，Reddy L A，Mandapaka M. In planta transformation of sorghum [Sorghumbicolor(L.) Moench] usingTPS1 gene for enhancing tolerance to abiotic stresses[J]. Journal of Genetics，2015，94(3)：425-434.

[13]Elkonin I A，Lopushanskaya R F，Pakhomova N V. Initiation and maintenance of friable，embryogenic callus of sorghum [Sorghumbicolor(L.) Moench] by amino acids[J]. Maydica，1995，40：153-157.

[14]Pandey A K，Bhat B，Balakrishna D，et al. Genetic transformation of sorghum [Sorghumbicolor(L.) Moench.][J]. International Journal of Biotechnology and Biochemistry，2010，6(1)：45-53.

[15]Wu E，Lenderts B，Glassman K，et al. OptimizedAgrobacterium-mediated Sorghum transformation protocol and molecular data of transgenic sorghum plants[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，2013，50(1)：9-18.

[16]Jambagi S，Bhat R S，Bhat S，et al. Agrobacterium-mediated transformation studies in sorghum using an improvedgfpreporter gene[J]. SAT Agricultural Research，2010，8：1-5.

[17]Umamaheswari S. Agrobacterium mediated transformation of sorghum bicolor for disease resistance[J]. International Journal of Pharma and bio Sciences，2010，1(4)：272-281.

[18]Jeoung J，Krishnaveni S，Muthukrishnan S. Optimization of sorghum transformation parameters using genes for green fluorescent protein andβ-glucuronidase as visual markers[J]. Hereditas，2002，137(1)：20-28.

[19]Khanna H K，Daggard G E. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of wheat using a superbinary vector and a polyamine-supplemented regeneration medium[J]. Plant Cell Reports，2003，21(5)：429-436.

[20]Gao Z，Xie X，Ling Y，et al. Agrobacterium tumefaciens-mediated sorghum transformation using a mannose selection system[J]. Plant Biotechnology Journal，2005，3(6)：591-599.

[21]Gurel S，Gurel E，Miller T I，et al. Agrobacterium-mediated transformation ofSorghumbicolorusing immature embryos[J]. Methods in Molecular Biology，2012，847(10)：109-122.

[22]Urriola J，Rathore K S. Temporal and spatial activities of a rice glutelin promoter in transgenic sorghum[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2014，116(2)：227-234.

[23]Joersbo M. Advances in the selection of transgenic plants using non-antibiotic marker genes[J]. Physiologia Plantarum，2001，111(3)：269-272.

[24]Girijashankar V，Swathisree V. Genetic transformation of Sorghum bicolor[J]. Physiology and Molecular Biology of Plants：an International Journal of Functional Plant Biology，2009，15(4)：287-302.

[25]Ellar D. Colloid-osmotic lysis is a general feature of the mechanism of action ofBacillusthuringiensisδ-endotoxins with different insect specificity[J]. Biochimica et Biophysica acta，1987，924(3)：509-518.

[26]劉宣雨，王青云，劉樹君，等. 高粱遺傳轉化研究進展[J]. 植物學報，2011，46(2)：216-223.

[27]Lowe B. Factors influencingAgrobacterium-mediated transformation of monocotyledonous species[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，2004，40(1)：31-45.

[28]Zhao Z，Glassman K，Sewalt V. Nutritionally improved transgenic sorghum[C]// Vasil I K. Plant Biotechnology 2002 and Beyond，Florida：Kluwer Academic Publishers，2003：413-416.

[29]Alan P. Development of transgenicSorghumbicolor(L.) Moench resistant to theChilopartellus(Swinhoe) throughAgrobacterium-mediated transformation[J]. Molecular Biology and Genetic Engineering，2014，2(1)：1-8.

[30]張明洲，唐 喬，陳宗倫，等. 農桿菌介導Bt基因遺傳轉化高粱[J]. 生物工程學報，2009，25(3)：418-423.

[31]朱 莉，郎志宏，李桂英，等. 農桿菌介導甜高梁轉Btcry1Ah的研究[J]. 中國農業科學，2011，44(10)：1989-1996.

[32]Howe A，Sato S，Dweikat I，et al. Rapid and reproducibleAgrobacterium-mediated transformation of sorghum[J]. Plant Cell Reports，2006，25(8)：784-791.

[33]劉公社，周慶源，宋松泉，等. 能源植物甜高粱種質資源和分子生物學研究進展[J]. 植物學報，2009，44(3)：253-261.