高效誘導子的制備方法及誘導成分研究

聶 麗， 游思遠， 樊聰靜， 黎軼凡， 歐陽瀟瀟， 魏賽金

(江西農業大學生物科學與工程學院/江西省農業微生物資源開發與利用工程實驗室，江西南昌 330045)

誘導子是植物抗病生理過程中能夠誘發植物產生植保素和引起植物過敏反應的因子，在植物與微生物的相互作用中，能快速、高度專一性地誘導特定基因的表達[1]。生物誘導子是誘導子中的一類，是植物、微生物在防御過程中為對抗其微生物侵染而產生的物質，主要包括分生孢子(conidia)[2]、降解細胞壁的酶類[3]、有機體細胞壁碎片[4]、有機體產生的代謝物[5]以及培養物濾液中的成分，如真菌菌絲體和細菌的菌體、勻漿、細胞壁成分、培養物濾液等。

目前，制備生物誘導子的方法有物理[6-7]、化學[8]方法，真菌誘導物起作用的成分主要來自菌絲體，人們普遍用的有3種制備方法：將菌絲體研磨成勻漿，勻漿液高壓滅菌制得真菌誘導子；將菌絲體濾去，將濾出液滅菌作為誘導子；將菌絲體烘干后研磨成均勻的干粉制得誘導子[5，8]。

筆者所在項目組在以棉花枯萎病為靶標的農用抗生素產生菌的分離篩選中，從棉花地土壤中分離篩選到1株鏈霉菌702[9]；進一步從其發酵產物中分離提取的抗真菌活性物質為多烯類大環內脂抗生素，命名為“農抗702”(antifungalmycin 702)[10]，該組分對水稻紋枯病病菌、稻瘟病病菌、稻曲病病菌等14種植物病原真菌有明顯的抑制作用[11-12]，但鏈霉菌702合成農抗702的量很低。筆者所在項目組前期試驗篩選出大腸桿菌制備物的誘導子，加入鏈霉菌702發酵后，農抗702的產量明顯提高[13]。本試驗以大腸桿菌制備誘導子為研究對象，獲得菌體，探討研磨法、凍融法、研磨法+凍融法、超聲波破碎法、微波破碎法、化學滲透法、自溶法、酶溶法破碎大腸桿菌細胞獲得的誘導子對鏈霉菌702發酵效果，以確定制備高效細菌誘導子的方法，并通過有機溶劑萃取分離法，對誘導子的主要作用成分進行初步分析。

1 材料與方法

1.1 菌種

鏈霉菌702(Streptomyces702)、桔青霉菌(Penicilliumcitrinum)、大腸桿菌(Escherichiacoli)均為江西農業大學生物科學與工程學院生物工程實訓基地的保藏菌種。

1.2 培養基

LB培養基：10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母膏，10 g/L氯化鈉，pH值7.0。PDA培養基：200 g/L馬鈴薯，20 g/L蔗糖，20 g/L 瓊脂，pH值自然。PDB培養基：200 g/L馬鈴薯，20 g/L 蔗糖，pH值自然。種子培養基：200 g/L馬鈴薯，20 g/L 蔗糖，pH值自然。以上培養基所用馬鈴薯均去皮煮沸，紗布過濾，取濾液。

發酵培養基：16.83 g/L玉米淀粉，30 g/L玉米粉，15 g/L大豆餅粉，20 g/L葡萄糖，8.64 g/L蛋白胨，0.3 g/L磷酸二氫鉀，5 g/L硝酸鉀，5 g/L氯化鈣，10 g/L大豆油，起始(消前)pH值8.0。

1.3 方法

1.3.1 制備細菌誘導子 大腸桿菌活化后，取50 mL接入250 mL三角瓶中培養24 h后，按接種量10%裝接到 2 000 mL 三角瓶中(總裝液量400 mL)，振蕩培養3 d，離心過濾獲得菌體。將菌體與蒸餾水按1 g ∶4 mL料液比混勻，獲得的濕菌體，分別采用研磨法、凍融法、研磨法+凍融法、超聲波破碎法、微波破碎法、化學滲透法、自溶法、酶溶法進行細胞破碎，收集處理后的細胞破碎液，分別滅菌，4 ℃保存備用。

研磨法：將濕菌體用液氮研磨，反復研磨1、2、3、4、5 次，每次研磨5 min。

反復凍融法：將濕菌體分別于-80、-20、4 ℃冷凍后，分別在45 ℃水浴、室溫(30±2)℃下融解10 min，每個處理總共凍融4次，每次1 h；將6個處理按照順序分別編號為1、2、3、4、5、6(-80 ℃冷凍+40 ℃水浴處理、-80 ℃冷凍+室溫處理分別記為處理1、處理2，以此類推)。

研磨法+凍融法：將濕菌體于-20 ℃冷凍后，取出于室溫融解后研磨5 min，反復進行5次。

超聲波破碎法：將濕菌體在冰浴條件下用超聲細胞破碎儀破碎，頻率為20 kHz，每次輻射5 s，間隔5 s，10 min 1次，共5次?？傒椛浯螖禐?0次。

微波破碎法：將濕菌體加入聚四氟乙烯管中，密封后放入微波爐中，以2 450 MHz的頻率和630 W的最大輸出功率照射3 min，考察重復次數為1、2、3、4、5次的水平，每次中間間隔冷卻1 min。

化學滲透法：向濕菌體中加入不同濃度甘氨酸(1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mol/L)和絲氨酸(0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mol/L)，然后將其置于恒溫(45 ℃)搖床中振蕩處理24 h。

自溶法：向濕菌體中分別加入不同質量分數(1%、2%、3%、4%、5%)NaCl，然后將其置于恒溫(45 ℃)搖床中振蕩處理24 h。

酶溶法：向濕菌體中加入不同濃度(0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL)的溶菌酶，然后將其置于恒溫(45 ℃)搖床中振蕩處理不同時間(4、14、24 h)。

1.3.2 誘導子含糖量 用二硝基水楊酸(DNS)法測定[14]各種誘導子的還原糖含量。以葡萄糖濃度(x)為橫坐標，以各個濃度對應的D550 nm(y)為縱坐標，標準曲線為y=0.719 1x-0.099 0，r2=0.999 3，查標準曲線可求出還原糖的濃度。

1.3.3 誘導子中主要活性成分分析 將制備好的誘導子于8 000 r/min離心20 min，得到沉淀部分(A1)，用終濃度為95%的預冷乙醇處理誘導子的上清液，將混合物置于4 ℃冰箱內，12 h后于8 000 r/min離心20 min，得到沉淀部分(A2)，沉淀部分的主要成分是多糖、糖蛋白，去除上清中的乙醇得到液相部分(B)[5]。液相部分(B)分別用3倍體積的石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和丁醇進行萃取，每種萃取液都用旋轉蒸發儀去除有機溶劑進行收集，得到石油醚萃取物(C)、三氯甲烷萃取物(D)、丁醇萃取物(E)和乙酸乙酯萃取物(F)[15]。將這些成分在鏈霉菌702發酵35 h時加入，分析誘導子的主要誘導成分和效應，以未添加誘導子的發酵液為空白對照。

1.3.4 鏈霉菌702發酵液抑菌活性的測定 將培養64 h的鏈霉菌702種子液，按10%接種量轉接到發酵培養基中，30 ℃、180 r/min振蕩培養，培養至35 h時，將還原糖濃度為 3.1 μg/mL 的大腸桿菌誘導子加入發酵液中繼續培養至7 d，取樣，測定發酵液的生物活性；以添加未處理過的誘導子為對照，不同處理方法的誘導子活性測定，以及誘導子中主要活性成分分析中的發酵液抑菌活性采用一劑量法測定效價[16]。發酵液效價標定以那他霉素(natamycin)作為對照抗生素，以橘青霉為指示菌測定抑菌圈，以對照抗生素的各個濃度的對數為橫坐標(x)，以各濃度對應的抑菌圈直徑校正值為縱坐標(y)，制得回歸方程為y=20.301x-9.878 5，r2=0.977 5，換算出發酵液的效價。

1.4 數據分析處理

采用OriginPro9軟件、DPS統計分析軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 不同制備方法所得誘導子的還原糖含量及對農抗702效價的影響

2.1.1 物理法 由表1可知，凍融法與研磨法結合使用，誘導子的含糖量均比單一使用研磨法或反復凍融法的高，且處理次數為3次時，含糖量達到了最高值，為1.46 mg/mL，比CK組提高了256.10%。凍融法+研磨法的處理次數為2次時，誘導子誘導鏈霉菌702產農抗702的效果最佳，比CK組提高了19.85%。由圖1可知，微波次數為3次，即9 min時，誘導子含糖量比CK組提高了238.11%，而誘導子誘導鏈霉菌702產農抗702的最佳時間為6 min。由圖2可知，超聲破碎總時間為30 min時，誘導子含糖量最高，比CK組提高了 193.37%，此時誘導子誘導鏈霉菌702產農抗702的效果最佳，比CK組提高了23.83%。

表1 機械破碎對誘導子的還原糖含量及農抗702效價的影響

注：表中數據為3次重復的“平均值±標準差”。同列數據后不同小寫字母表示經Duncan氏新復極差法檢驗差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

2.1.2 化學滲透法 由表2可知，隨著絲氨酸濃度的增加，誘導子的含糖量增加，誘導鏈霉菌702產農抗702的效果增強，當絲氨酸濃度為0.50 mol/L時，誘導子的含糖量、農抗702的效價達到了最大值，分別比CK提高了56.10%、37.95%；之后隨著絲氨酸濃度的增加，誘導子的含糖量及誘導效果降低。甘氨酸濃度僅為1.5 mol/L時，處理的誘導子含糖量及誘導產農抗702的量高于CK，說明絲氨酸處理的效果明顯高于甘氨酸處理。

2.1.3 酶溶法與自溶法 由圖3、圖4可知，不同保溫時間及不同溶菌酶濃度處理對誘導子還原糖與農抗702效價的影響不同，整體而言，保溫時間越長，誘導子含糖量越高，溶菌酶濃度為1.2 mg/mL， 保溫時間為24 h時， 誘導子含糖量達到最大值，為0.95 mg/mL，比CK提高了131.96%，差異顯著；在溶菌酶濃度為0.8 mg/mL，保溫時間為24 h時，誘導子誘導鏈霉菌702產農抗702的量最高，為380.88 μg/mL，比CK提高了39.70%，差異顯著。

表2 不同濃度的絲氨酸和甘氨酸處理對誘導子還原糖含量及農抗702效價的影響

由圖5可知，應用自溶法處理的誘導子，隨著NaCl濃度增加，誘導子的含糖量隨著增加，在NaCl濃度為4%時，誘導子的含糖量達到最大值，為0.84 mg/mL，比CK提高了104.04%，差異明顯，之后隨著NaCl濃度的增加而降低；誘導子誘導鏈霉菌702產農抗702的量雖然與誘導子含糖量的變化趨勢一致，當NaCl濃度為4%時，農抗702效價達到最大值，比CK提高了11.03%，差異明顯，但是NaCl濃度在1%～2%間時，農抗702效價低于CK。

2.2 誘導子中主要作用成分分析

由圖6可知，沉淀部分A1、A2對農抗702的合成誘導活性最好，較CK分別提高了37.91%、25.82%，差異顯著；液相部分B能夠提高農抗702的產量，比CK提高了18.04%；其他4 種萃取物和萃余液，除了乙酸乙酯萃取物F對農抗702的生物合成有誘導作用，較對照提高了15.52%，其他3種萃取物幾乎沒有誘導活性。由結果可知，細菌誘導子中起主要誘導活性的是蛋白、多糖類物質，此外，一些非蛋白、非多糖類的小分子物質對農抗702的合成具有誘導作用，并且其極性與乙酸乙酯相近。

3 小結與討論

本研究通過5種物理破碎法處理大腸桿菌后制備成誘導子，其中凍融法與研磨法結合的處理次數為3次時，含糖量達到最高值，為1.46 mg/mL，比CK提高了256.10%，這與趙亞娥等的結果[17]相似，可能的原因是-20 ℃使大腸桿菌細胞迅速凍結后溫度降至-20 ℃，后又突然回到常溫融化，加上研磨，這種猝冷和常溫反復交替的過程，使大腸桿菌細胞壁兩側出現很大的溫差，產生熱應力，引起細胞壁斷裂，促使胞壁物質大量釋放。而超聲破碎總時間為30 min所得誘導子誘導鏈霉菌702產農抗702的效果最佳，比CK提高了 23.83%。這與戴佳錕等的研究結果[18]相似。即在破碎時間為30 min時，破碎率最高，且外源蛋白活性高。

通過加入絲氨酸、甘氨酸2種溫和化學滲透劑處理大腸桿菌后制備成誘導子，當絲氨酸濃度為0.50 mol/L時，誘導子的含糖量以及農抗702的效價達到了最大值，分別比CK提高了56.10%、37.95%；絲氨酸處理的誘導子含糖量高于甘氨酸的處理，這與李夏蘭等的研究結論[19]相反，可能的原因是化學滲透劑作用的細胞壁結構有差異，大腸桿菌是革蘭氏陰性細菌，而李夏蘭等研究的是酵母菌，屬于真菌。且絲氨酸處理的誘導子誘導農抗702合成的量不僅比甘氨酸處理的高，還比物理處理法的高，可能的原因是絲氨酸本身對鏈霉菌702合成農抗702具有誘導活性，具體原因有待進一步研究。

溶菌酶通過水解肽聚糖上N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的β-1，4糖苷鍵，進入細胞，改變細胞表面的結構和環境，使細胞內環境的平衡被打破，隨后導致細胞壁溶解[20]。溶菌酶濃度為1.2 mg/mL，保溫時間為24 h時，誘導子含糖量達到最大值，為0.95 mg/mL，比CK提高了 131.96%；同時在溶菌酶濃度為0.8 mg/mL，保溫時間為24 h時，誘導子誘導鏈霉菌702產農抗702的效果最好，為 380.88 μg/mL，比CK提高了39.70%。以上結果說明，保溫時間越長，誘導子的含糖量及誘導效果越好。這與賈艷萍等的結果[21]相反，雖說反應條件不同，但是溶菌酶破壁是一種溫和無公害的方法，有利于誘導子誘導農抗702的積累。

自溶法主要利用細胞內外滲透壓的差異進行細胞破碎，在NaCl濃度為4%時，誘導子的含糖量達到最大值，誘導效果最佳，這與單振秀等的研究結果[22]一致。細菌誘導子雖能有效地促進農抗702的生物合成，但具體的作用成分還不清楚。本試驗采用有機溶劑萃取分離的方法，將細菌誘導子懸浮液進行分離，進而測定各種萃取部分對農抗702合成的誘導活性。結果表明，細菌誘導子中起主要誘導活性的是蛋白、多糖類物質，此外一些非蛋白、非多糖類的小分子物質對農抗702的合成具有誘導作用，并且其極性與乙酸乙酯相近，這與王亞洲等的研究結果[15]相反，可能的原因是真菌代謝物與細菌細胞壁的成分存在差異。

本研究通過物理、化學、生物法處理大腸桿菌菌體制備成誘導子，且進一步研究了這些誘導子對鏈霉菌702合成農抗702的誘導效應，為生物誘導子的制備方法體系提供了理論依據。本試驗初步研究了誘導子的主要成分的誘導活性，具體是何種成分物質還有待進一步研究。

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