不同培養條件對紫萁原葉體發育的影響

鄧 坦， 周 遜， 張 念

(1.遵義師范學院生物與農業科技學院，貴州遵義 563006； 2.貴州省赤水河流域植物資源保護與應用研究特色重點實驗室，貴州遵義 563006)

紫萁(OsmundajaponicaThunb)屬蕨類植物門真蕨類原始厚囊蕨綱紫萁目紫萁科紫萁屬的一種多年生草本植物，既是一種山野菜又是一種名貴中藥材[1]。其拳卷幼葉經過干制處理，稱為薇菜，是出口日、韓的名貴山野菜。紫萁根莖入藥，具有一定的應用價值，很多研究表明，薇菜含有鈣(Ca)、鐵(Fe)、鋅(Zn)等元素和多種氨基酸，具有較高的營養成分[2-3]，但其自然繁殖能力弱，不利于種群的擴大和人工栽培。目前，中國產的薇菜均為采自山區的野生紫萁，質優，無污染。近年來，由于濫采，其野生資源日漸枯竭，產品供不應求，為合理開發這一珍稀資源，提高其品率，滿足市場需求，進行人工規模栽培勢在必行，而人工栽培的關鍵是解決紫萁成苗問題，對其孢子萌發條件的研究是解決其有性生殖問題的重要條件之一。

國內外對紫萁孢子的人工繁殖已有研究[1，4-11]，但對一些控制紫萁孢子萌發和原葉體發育的因素還有待更深入的研究。本試驗就不同碳源濃度、不同激素水平、不同成熟度的紫萁孢子這幾個因素對紫萁原葉體發育的影響進行探究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紫萁孢子體材料于2013年4月中旬采自貴州遵義大板水國家級森林公園，所采集的試驗材料由遵義師范學院生命科學學院植物資源實驗室鑒定，并保存標本。采集不同成熟度的孢子葉穗，放入潔凈的密封袋中，置于5 ℃冰箱中保存供使用。

1.2 不同培養基的配制

無機培養基采用MS、1/2MS、1/4MS(1/2MS、1/4MS培養基的大量元素含量分別為MS培養基全量的1/2、1/4，鐵鹽和有機物的含量與MS培養基相同)，pH值為6.0，培養基配制好后分裝到培養瓶中，培養基于121 ℃高壓滅菌120 min。

1.3 消毒方式

取適量不同成熟度的孢子體，先用適量洗衣粉洗10 min，洗去表面雜質，然后用自來水沖洗30 min，再然后用75%乙醇處理 1 min 后用無菌水清洗3～4次，再用0.1%氯化汞處理 8 min，最后用無菌水清洗3～4次后就可進行接種。

1.4 正交試驗

本試驗分3個組合：組合1以MS、1/2MS、1/4MS為基本培養基，附加不同濃度的蔗糖，pH值6.0，培養不同成熟度的外植體；組合2以MS、1/2MS為基本培養基，附加不同濃度的6-BA和NAA，pH值6.0，培養不同成熟度的外植體；組合3以MS、1/2MS為基本培養基，附加不同濃度的6-BA、2，4-D，pH值6.0，培養未完全成熟的外植體。

將各個處理置于光照時間12 h/d、光照度2 000 lx、溫度25 ℃的條件下培養，定期觀察其生長情況，3 d后觀察孢子的萌發情況，定期記錄孢子顏色的變化，25～30 d后分別對每個處理在顯微鏡下觀察原葉體的形態結構，并統計每種處理條件下的孢子萌發率。

2 結果與分析

2.1 不同蔗糖和無機鹽濃度對紫萁孢子萌發和原葉體發育的影響

由表1可以看出，不同蔗糖濃度和無機鹽濃度能影響紫萁孢子的萌發和原葉體的發育。蔗糖濃度為2%的培養基比含量為3%的培養基更有利于孢子的萌發和原葉體的發育(圖1-A)。1周后孢子開始萌發，表面開始分化出一些綠色小點，這與張敏等對紫萁的組織培養而得出的結論[5]相符合。在沒有添加任何植物激素的條件下培養紫萁孢子，成熟度為3的紫萁孢子的萌發率為0，成熟度為1的紫萁孢子的萌發率最高，最高達 66.67%(表1)。

表1 不同蔗糖和無機鹽濃度對紫萁孢子萌發和原葉體發育的影響

注：成熟度為1表示還未完全成熟的紫萁孢子，孢子還略顯綠色；成熟度為2表示剛成熟的紫萁孢子；成熟度為3表示已成熟了一段時間的紫萁孢子。萌發時間為“-”表示未萌發。原葉體發育情況為“-”表示無原葉體出現，“+”表示出現原絲體，“++”表示出現片狀體和幼原葉體，“+++”表示出現心形原葉體。下表同。

2.2 不同濃度無機鹽、6-BA、NAA對紫萁孢子萌發和原葉體發育的影響

由表2可以看出，不同濃度無機鹽、6-BA、NAA均影響紫萁原葉體的發育，無論什么樣的濃度配比，成熟度為1的孢子體萌發率都要高于成熟度為2和3的萌發率，成熟度為3的孢子體在1/2MS、1.0 mg/L 6-BA、0.01 mg/L NAA條件下有幼原葉體和片狀體的發育。

在MS+0.1 mg/L 6-BA+成熟度1和1/2MS+0.1 mg/L 6-BA+成熟度1條件下紫萁原葉體發育最好(圖1-C)。在MS+0.5 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+成熟度1和MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+成熟度1條件下還是片狀體(圖1-B)，在1/2MS+0.5 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+成熟度3的條件下處于2～6個細胞的絲狀體(圖1-A)，在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+成熟度1和1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+成熟度1條件下的原葉體發育較好(圖1-C)。

2.3 不同濃度無機鹽、6-BA、2，4-D對紫萁孢子萌發和原葉體發育的影響

由表3可以看出，不同無機鹽、6-BA、2，4-D濃度能影響紫萁原葉體的發育，0.1、0.5、1.0 mg/L 2，4-D都有利于紫萁原葉體的發育，0.5 mg/L為最佳濃度。在不同濃度外源激素條件下紫萁原葉體發育不同，在MS+0.1 mg/L 2，4-D(無6-BA)與MS+0.5 mg/L 2，4-D(無6-BA)和1/2MS+0.5 mg/L 2，4-D(無6-BA)的條件下，發育為心形原葉體的時間較快(圖1-C)，在MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2，4-D條件下為片狀體(圖1-B)。

3 討論

在外植體的選擇上，筆者所在課題組選取了3種不同成熟度的穗狀孢子體：成熟度為1，孢子體顏色為青綠色；成熟度為2，孢子體剛由青色轉黃色；成熟度為3，孢子體由黃色轉褐色。無論是在何種條件的處理下，成熟度為1的孢子體萌發要好于成熟度為2、3的孢子體，究其原因，成熟度為1的孢子體未成熟，細胞還未分化完成，在適度培養條件的刺激下，更能激發細胞的全能性。

在無機鹽濃度的選擇上，筆者所在課題組選擇了3種濃度，分別是1MS、1/2MS、1/4MS。由結果看出，在低濃度無機鹽條件下，孢子萌發率較高，這在實際生產過程中對于控制成本是有益的。

在碳源濃度選擇上，筆者所在課題組選擇了2種濃度進行比較，分別是3%、2%蔗糖。由結果看出， 在2%的低碳源濃度下，孢子萌發較好，這在大規模的實際生產過程中，對于控制成本也是有益的。

表2 不同濃度無機鹽、6-BA、NAA對紫萁孢子萌發和原葉體發育的影響

不同無機鹽濃度、6-BA濃度、NAA濃度均影響紫萁原葉體的發育。由結果可以看出，無論什么樣的濃度配比，成熟度為1的孢子體萌發率都要高于成熟度為2、3的，成熟度為3的孢子體在1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA培養條件下有絲狀體和片狀體的發育。

不同濃度無機鹽、6-BA和2，4-D的配比試驗表明，0.1、0.5、1.0 mg/L 2，4-D都有利于紫萁原葉體的發育，0.5 mg/L 為2，4-D最佳濃度。

在控制條件下，碳源濃度為2%的培養基有利于孢子的萌發和原葉體的形成；隨著無機鹽濃度的降低，孢子萌發率上升，以1/4MS最佳；1 mg/L 6-BA更有利于紫萁原葉體的發育；NAA濃度為0.01 mg/L，原葉體長勢較好；0.1～1 mg/L 2，4-D均有利于紫萁原葉體的發育，其中0.5 mg/L為最佳濃度；還未完全成熟的孢子體的萌發率較高，最高達50%以上。在2%蔗糖+1/4MS+1 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+0.5 mg/L 2，4-D和孢子體未完全成熟的條件下，更有利于紫萁原葉體的發育。

表3 不同濃度無機鹽、6-BA、2，4-D對紫萁孢子萌發和原葉體發育的影響

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