褪黑素增強鹽害條件下水稻幼苗對稻瘟病的抗病能力

許秋怡，陳兆暉，季富宴，時浩杰

(浙江農林大學農業與食品科學學院，浙江杭州 311300)

褪黑素是一種重要的植物生長調控劑，能促進植物抗病以及抗各種非生物脅迫[1-2]，可促進植物種子在逆境下發芽[1]，還可促進老化的種子恢復活力[3]。對于褪黑素具有的這些多重功能，其主要調控機理是因為它不但能直接清除活性氧，還能調控抗氧化酶基因表達[1-2]。此外，褪黑素還能調控植物抗病信號途徑如水楊酸信號途徑等[2]。

植物不同于動物，為了抵御來自于環境中的非生物脅迫(干旱、鹽害、水澇、紫外線、重金屬等)及生物脅迫(病原菌和蟲害等)，它們在長期的進化過程中發展出一套精細、高效和完整的防衛系統[4]。在抵御非生物脅迫中，為消除活性氧自由基的毒害，所有有氧植物都進化出能清除這些毒害分子的抗氧化酶[如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POX)等]和抗氧化代謝物質[如類胡蘿卜素、維生素C、維生素E、谷胱甘肽(GSH)等][5]。類似地，植物在抵抗病害過程中，同樣有很多防衛酶[如多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)等]和次生代謝物(酚類物質等)參與抵御反應[6]。當然，也有文獻報道抗氧化酶在植物抗病過程中發揮一定作用[7]。在自然環境條件下，植物很少只面臨單一的環境脅迫，往往幾種脅迫因子同時出現[8-9]。例如，水澇條件下又面臨著病害的出現，干旱條件下又面臨著蟲害的威脅。一般來講，植物同時遭遇2種及2種以上較嚴重的環境脅迫時，后果是很嚴重的，往往導致植物死亡[8]。

水稻是我國南方和東北主要的農作物。在東北，水稻種植往往同時面臨低溫、鹽堿以及病害等多重危害。其中，稻瘟病是一種危害極嚴重的病害[10]。這種真菌病害的發病嚴重程度除了與其生理小種致病力和水稻品種抗病力有關外，更與環境因素有密切關系。低溫能導致水稻抗稻瘟病能力顯著下降，而氮肥的過多施加也會導致其發病更嚴重[11-16]。目前對于作物應答單一脅迫的研究較多，對于多重脅迫的應答研究較少[8-9]。而鹽害和病害都會誘導植物產生活性氧從而為害植物生長[17-18]。此外，一些保護酶如SOD、POX、PPO在植物抗病抗逆中發揮著重要作用[19]。鑒于此，筆者在生理水平上對鹽脅迫條件下的水稻先噴灑褪黑素，然后接種稻瘟菌，觀察了其抗病反應，以期為了解褪黑素對逆境下作物抗病的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料選取水稻品種中早39秈稻15日齡幼苗為植物材料。菌種為稻瘟菌ZB15，為國內標準鑒定生理小種。

1.2方法

1.2.1水稻幼苗培養。采用實驗室水培方法。將發芽7 d左右(3葉期)的水稻幼苗從沙土中轉移到塑料盆中(事先放置有鉆孔的有機泡膜)，盆中加有1/10強度的Hoagland營養液。將全部塑料盆置于培養箱中，光照強度為250 μmol/(m2·s)，每天光照12 h。晝夜溫度分別為30/20 ℃。待水稻苗適應性生長14 d后，清除生長不良的苗子，其他生長一致的健康苗子供處理用。

1.2.2菌種及其活化。參照董漢松[20]教授主編的《植病研究方法》，采用燕麥培養基培養稻瘟菌孢子。向平板中無污染的稻瘟菌菌落加適量滅菌后的蒸餾水，并置于光照下促進孢子生成。孢子使用前用蒸餾水洗下，稀釋到1×106個/mL的濃度水平。為促進孢子更好地吸附到水稻葉片上，在孢子的稀釋液中加0.02%吐溫-20，混合均勻后，置于噴壺中，用于水稻葉片噴霧處理。

1.2.3接菌處理。將15日齡的水稻幼苗移到含有50 mmol/L NaCl的1/10強度Hoagland營養液中適應性培養4 d，對幼苗噴灑不同濃度(0、0.1和1.0 mmol/L)褪黑素，12 h后接種事先活化的稻瘟菌，再置于溫室條件下(注意保濕)觀察其發病情況。對照組為不含NaCl的營養液中接種稻瘟菌。

1.2.4保護酶活力檢測。參照張蜀秋[21]主編的《植物生理學實驗技術教程》上的實驗方法，對不同時期(噴灑褪黑素后0、24和48 h)的葉片取樣檢測酶活力。SOD酶活力測定：收集200 mg水稻幼苗第3片葉，在預冷的研缽中加入2 mL PBS緩沖液(pH 7.0)，在冰塊上研磨成勻漿，加入緩沖液至5 mL，在4 ℃下12 000 r/min離心30 min，上清液即為SOD抽提液，置于冰箱中保存待測。利用NBT法在560 nm處比色獲取吸光值，每個酶活力單位定義為將NBT還原抑制到對照50%時所需的酶量。PPO酶活力測定：稱取1 g水稻幼苗第3片葉組織，用5 mL 預冷的50 mmol/L PBS磷酸緩沖液(pH 7.8)研磨，再加入5 mL緩沖液洗下，倒入20 mL離心管中，4 ℃、14 000 r/min離心30 min，收集上清。所用反應體系為3 mL 200 mmol/L鄰苯二酚(用pH 7.8磷酸緩沖液配制)、1 mL酶液，以滅活的酶液為空白對照，25 ℃水浴20 min，立即用20%三氯乙酸中止反應。在14 000 r/min下離心10 min，用分光光度計在495 nm處測定吸光度。1個酶活力單位定義為0.1個OD吸光度。

2 結果與分析

2.1在鹽害條件下褪黑素增強對稻瘟病的抗病能力采用每株水稻苗上的平均病斑數評價抗病能力。病斑數越多表示抗病能力越弱，反之亦然。取5株幼苗在接菌后7、14和21 d病斑數的平均值。由圖1可知，與對照相比，鹽害顯著降低了水稻對稻瘟病的抵抗力，7、14和21 d病斑數分別比對照增加了125%、145%和172%。然而，噴灑低濃度(0.1 mmol/L)和高濃度(1.0 mmol/L)褪黑素則顯著增強了水稻在鹽害條件下的抗病能力，第21天病斑數分別比鹽害對照減少了27%和42%。這說明噴灑褪黑素能顯著增強水稻幼苗在鹽害條件下的抗稻瘟病的能力。

圖1 鹽害條件下噴灑褪黑素后水稻稻瘟病的發病情況Fig.1 The occurrence condition of rice blast under salt stress after spraying melatonin

2.2褪黑素增強保護酶活力水稻幼苗噴灑褪黑素后0、24和48 h取其第3片葉測定SOD和PPO活力。由圖2可知，鹽害顯著降低了SOD活力。接菌后有輕微上升，然后噴灑低濃度褪黑素后，酶活力顯著上升。噴灑褪黑素24和48 h后，相對于鹽害+稻瘟菌組，鹽害+稻瘟菌+褪黑素組的葉片酶活力分別上升了72%和92%。PPO活力趨勢與SOD相同，噴灑褪黑素24和48 h后，相對于鹽害+稻瘟菌組，鹽害+稻瘟菌+褪黑素組的葉片PPO活力分別上升了38%和47%(圖3)。

圖2 噴灑褪黑素后水稻幼苗的SOD活力Fig.2 SOD activity of rice seedlings after spraying melatonin

圖3 噴灑褪黑素后水稻幼苗的PPO活力Fig.3 PPO activity of rice seedlings after spraying melatonin

3 結論與討論

植物在其生命周期中面臨著三大任務：生長、防衛以及繁殖。在進入繁殖階段以前的苗期階段，生長和防衛是2個主要的任務[22]。一般來講，當植物面臨環境脅迫(非生物和生物脅迫)時，其生長會受到不同程度的抑制。這可能一方面與其光合作用受到抑制有關，另一方面也與其將更多的資源(如光合作用產物)轉移投放到防衛物質合成而非生長上有關[23]。而當同時面臨2種脅迫，如鹽害和病害時，除不得不增加更多防衛物質合成外，還存在如何將這些資源合理分配到這兩類不同性質的防衛物質的合成上的問題[23]。相對于單一脅迫，2種脅迫中的任何一種脅迫防衛能力都將相應被削弱。該研究也表明，鹽害作為一種嚴重的非生物脅迫，會顯著削弱水稻對病害的抵抗能力。這可能與降低相關保護酶(如SOD和PPO)活力有密切關系。SOD是最主要的活性氧清除酶，與植物抗逆境脅迫(如干旱、鹽害等)有密切關系[5]，也與植物抗病有密切關系。PPO主要與植物抗病有密切關系。該酶通過參與催化多酚類物質和木質素的合成發揮抗病作用[7]。在該試驗中，因為涉及到鹽害和病害，所以選擇這2個有典型代表性的指標作為主要研究對象。

褪黑素有多種調控作用，它既可以直接清除活性氧，減輕植物傷害，還能調控包括抗氧化酶在內相關基因的表達[1]。該研究中，將褪黑素噴灑幼苗后，能顯著增強其對稻瘟菌的抵抗能力，對于其機理的探討，著重從保護酶水平進行了研究，發現其能顯著增強保護酶的活力。對于其促進這2個酶活力的機制，除了其自身能清除活性氧從而減輕活性氧對2種酶的傷害外[1]，可能也與其能從基因水平調控這2個酶的基因表達有密切關系[1]。事實上，褪黑素本身就具有調控抗氧化酶(如SOD、CAT等)活力的能力[1]，還能誘導水楊酸等信號途徑[2]，而水楊酸信號途徑的激活也會促進水稻抗稻瘟病[24]。今后需進一步從分子水平研究褪黑素對保護酶基因的調控機制，以及如何調控水楊酸信號途徑從而發揮其在鹽害條件下促進水稻抵抗稻瘟菌侵襲的能力。

綜上得出以下結論：①鹽害能顯著降低水稻對稻瘟病的抵抗能力；②鹽害也會降低SOD和PPO的活力；③褪黑素處理水稻幼苗，能增強其抗稻瘟病的能力，同時激活SOD和PPO的活力。

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