接合菌藍光受體蛋白研究進展

葛欣 崔天琦 李興旺 謝錄翰 辛琪

（河北大學生命科學學院，保定 071002）

光是一種重要的環境因子，其對生物的生長發育和生理過程的調控在大多數物種中廣泛存在。真菌在長期進化過程中形成了精細的光信號感應機制，它們能夠對450 nm（藍光）-700 nm（紅光）波長范圍的光發生響應，而藍光及近紫外光（～400-495 nm）在真菌光形態發生和其他光響應過程中發揮最大的影響作用，包括菌絲形態、孢子生成、有性生殖及代謝途徑的激活等過程［1-2］。與植物相比，絲狀真菌光響應途徑不會受到光合作用等過程的干擾，因此選取絲狀真菌作為研究對象更有利于研究生物體感光的分子機制［3］，其中粗糙脈孢霉（Neurospora crassa）和布拉克須霉（Phycomyces blakesleeanus）是用于研究光生物學的模式菌株。布拉克須霉對環境信號感應非常敏感，自1950年以來一直將其作為感應生物學的模式菌株進行了較為深入系統的研究，并主要集中在對光信號的感應方面［4］；接合菌的另一代表菌株卷枝毛霉（Mucor circinelloides）由于是接合菌中唯一一個能夠進行遺傳操作的菌株，使得人們對光受體蛋白功能及響應機制的探究成為可能［5-6］。為了能夠全面了解接合菌在這方面的研究進展和不足，本文主要對接合菌的光受體蛋白種類和光調控重要生命活動的過程進行綜述，希望能對相關領域研究人員提供研究參考和切入點。

1 接合菌的光受體蛋白

1.1 White Collar蛋白

粗糙脈孢霉中的White Collar 1（WC-1）是在絲狀真菌中鑒定的第一個光受體蛋白，隨后WC-2作為在光調控中起關鍵作用的蛋白也被發現［7-8］，而WC-1和WC-2通過PAS結構域相互作用形成的WCC蛋白復合物（White collar complex）構成了迄今絲狀真菌中研究最為廣泛和明確的藍光響應模式系統［3，9］，這個蛋白復合物是目前所有已知藍光響應途徑所需的，除了具有藍光受體蛋白的功能，同時還作為轉錄因子與下游靶基因啟動子的光響應元件（Light response element，LRE）直接相互作用來調控靶基因的表達［10］。該復合物的同源蛋白也在多種絲狀真菌中相繼被發現和鑒定，包括子囊菌、擔子菌和接合菌［11-14］。madA和madB是Campuzano等［15］從布拉克須霉趨光性缺陷的突變體中分離鑒定的2個基因，其在菌株感光過程中發揮關鍵作用，蛋白序列分析結果表明，MadA和MadB分別為WC-1和WC-2的同源蛋白，酵母雙雜交實驗也證實了二者之間存在相互作用，推測其也能形成類似WCC的MAD復合物來調控光依賴基因的轉錄［16］。這說明WCC復合物不僅在絲狀真菌中廣泛存在，保守性強，而且在進化的早期就作為感光因子復合物發揮著重要作用。

隨著越來越多的物種全基因組測序的完成，white collar基因的多拷貝現象逐漸浮出水面。比如，布拉克須霉基因組中含有包括madA和madB在內的3個wc-1基因和4個wc-2基因［16-17］；卷枝毛霉存在3個wc-1類似基因和4個wc-2類似基因［16，18］；米根霉（Rhizopus oryzae）中已發現3個wc-1類似基因和5個wc-2類似基因［19］；晶澈水玉霉（Pilobolus crystallinus）中存在3個wc-1類似基因，而wc-2類似基因還未發現。這些證據表明wc基因多拷貝的現象在接合菌中普遍存在，可能執行不同的功能。

進一步研究結果表明，在藍光誘導基因表達過程中，布拉克須霉的這些多拷貝wc類似基因轉錄水平不同：wcoB和wcoA（均為wc-1類似基因）轉錄水平分別提高5倍和30倍，wctB和wctD（均為wc-2類似基因）分別提高180倍和250倍，wctC（wc-2類似基因）轉錄并未受到光誘導，而madA和madB的轉錄則受到輕微抑制，這說明不同拷貝的基因對光刺激后的反應不同［16］。此外，光激活wc類似基因所需的光強閥值也是不同的，這些差異都意味著多個wc基因在不同的光響應過程中發揮調控作用，功能出現了分化［16］。然而由于該菌株缺乏有效的遺傳轉化系統，阻礙了對感光過程wc基因功能的更為詳細的研究。卷枝毛霉是接合菌綱毛霉目中分子遺傳操作比較成熟的物種，這使得研究wc等相關基因功能成為可能［18］。因此研究者構建了3個wc-1類似基因的缺失突變體（Δmcwc-1a、Δmcwc-1b和Δmcwc-1c）用于研究基因功能的分化。通過大量實驗發現，MCWC-1a和MCWC-1c均能夠接收光信號，但二者接受光信號后下游調控作用的靶點不同，MCWC-1a主要參與控制卷枝毛霉孢子梗的趨光性行為，MCWC-1c則在藍光誘導類胡蘿卜素合成中發揮關鍵作用，這也說明卷枝毛霉中至少存在兩個不同的光傳導途徑，而Δmcwc-1b菌株由于具有與野生型相似的表型，一般認為與其他WC-1蛋白功能上重疊，或者以與光誘導無關的方式參與類胡蘿卜素合成等多種信號調控過程［18-20］。

以上研究表明，在物種進化過程中由于重復基因的出現，多拷貝的white collar基因逐步趨向亞功能化，不同的拷貝獲得了特定的功能，使得真菌對光信號的響應更加復雜和靈活。

1.2 隱花色素蛋白

隱花色素（Cryptochromes）最早是在植物中發現的一種能夠感應藍光和近紫外光的光受體蛋白，在植物的生長發育和生物鐘調控等過程中發揮重要作用［21-22］。隱花色素在絲狀真菌中也廣泛存在，如在粗糙脈孢霉、構巢曲霉（Aspergillus nidulans）、瑞氏木霉（Tricoderma reesei）、核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）、水稻惡苗病菌（Fusarium fujikuroi）等物種中都有研究報道，該受體蛋白不僅參與調控真菌生物周期節律、DNA光修復、孢子生成，還和真菌特異性次級代謝（如赤霉素、色素合成等）等生命活動有密切關系［23-25］。研究表明，隱花色素與環丁烷嘧啶二聚體（Cyclobutane pyrimidine dimer，CPD）光裂合酶和（6，4）-光裂合酶，均屬于隱花色素 /光裂合酶家族（Photolyase family，CPF）［26］。在多種植物和動物中發現的隱花色素由于蛋白C端長度的差別而與光裂合酶區別開來，通常僅僅發揮光受體的功能而缺少DNA修復活性［27］。然而有一個特例，隱花色素家族中的Cry-DASH在空間結構和光化學性質上與光裂合酶極為相似，它保留了部分DNA修復活性，能夠結合并修復單鏈DNA和雙鏈環狀DNA中的CPD［28-29］，因此被認為是隱花色素和光裂合酶的進化過渡態［22，27］。

接合菌布拉克須霉的CryA蛋白是隱花色素的Cry-DASH亞家族的成員，這個家族中還包括擬南芥的At-Cry3、斑馬魚的DrCry和粗糙脈孢霉的CRY等［26］。在這些同家族蛋白中，一些關鍵位點氨基酸存在高度保守性：如At-Cry3蛋白負責結合FAD基團的16個氨基酸位點中有15個位點在CRY中保守；CRY蛋白的氨基酸序列中負責結合MTHF基團的4個位點（E129、E130、E459和 Y465），以及結合CPD序列的6個位點（R281、E342、W345、N433、R434和Q437）也具有高度的保守性。這些關鍵序列和位點上的保守性說明它們以相似的作用方式執行共同功能［23，30］。

布拉克須霉具有典型的光復活現象，但與擔子菌和子囊菌在基因組上存在多拷貝的CPF家族蛋白不同，在布拉克須霉的基因組中目前僅發現1個cryA基因（編碼CPF蛋白），并不存在額外的隱花色素基因或典型的光裂合酶基因，這暗示著該菌必然通過僅有的這個CryA蛋白成功的完成光復活行為［23，26，31-32］。進一步研究證據說明，與其他已知的Cry-DASH亞家族蛋白不同，布拉克須霉的CryA蛋白不僅在體外對單鏈DNA和雙鏈DNA的嘧啶二聚體具有相同的修復效率，而且在體內能夠成功的回補大腸桿菌光裂合酶基因缺陷的表型。這充分證實除了作為UV-A/藍光的光受體蛋白發揮信號傳導功能之外，布拉克須霉的CryA還具有光裂合酶活性負責光導致的DNA損傷的修復，CryA也是該家族蛋白中目前唯一一個具有完整光裂合酶活性的蛋白［26］。此外，CryA發揮功能還和MAD復合物的活性有關。在適當的藍光照射下，野生型菌株中cryA基因轉錄水平顯著提高，madA或madB基因缺陷菌株中其轉錄量僅有輕微降低，而在madA和madB雙缺陷突變體中則幾乎檢測不到cryA mRNA的存在，表明cryA基因轉錄激活依賴于MAD復合物的活性［26］。由于MAD復合物的光化學變化并不足以揭示紫外光和紅光對布拉克須霉趨光性的影響［4］，在CryA蛋白發現后，更多的結果暗示其與MAD復合物的相互作用調控著光信號的傳遞，并在趨光性和其他光響應途徑中發揮重要作用。

隱花色素廣泛存在于接合菌中，在基因組信息檢索后發現，巴克斯毛霉（Backusella circina）、德氏根霉（Rhizopus delemar）和卷枝毛霉中各存在一個cry-DASH基因，拉曼傘形霉（Umbelopsis ramanniana）中鑒定出一個I類CPD光裂合酶基因，而其他菌株中暫時沒有發現有CPF家族蛋白的存在［19-26］。目前關于以上這些蛋白結構和功能，仍有待于更廣泛更深入的探究。

2 接合菌的光反應及光受體蛋白的調控

2.1 調控趨光性

早期研究發現，布拉克須霉的大孢囊梗在光源照射下朝向近紫外光和藍光的方向彎曲，并且在環境光強度變化后能夠短暫地調節孢囊梗的伸長率，表現出明顯的趨光性現象，這種趨光性在植物和真菌中具有共同特征［33-34］。該菌株對光刺激非常敏感，在10-9-10 W/m2的光強度區間內都能夠發生趨光性現象，由于布拉克須霉對光的高度敏感性，已成為研究生物趨光性的模式菌株［33］。Galland等［35］通過觀察不同波長和不同光強度下孢囊梗的向光彎曲率的動力學變化，認為該菌對低強度光和高強度光的趨光性響應是通過兩套不同的光系統來調控完成的。通過對不同波長的光源照射后的反應對比發現，菌株對藍光的正趨光效應最顯著；而暴露在紫外光時，菌株的孢囊梗呈現出負趨光性［36］；在紫外光和藍光同時反向照射的實驗中，藍光光注量大于10-4μmol·m-2·s-1時，孢囊梗彎曲率完全依賴于藍光；相反，二者同向照射，藍光與紫外光的光注量比值為1.37時，達到一個向光性的平衡，這說明藍光和紫外光的光受體是獨立的，并且現有證據表明它們還存在復雜的相互關系；在＞600 nm的紅光刺激下，菌株則呈現出與黑暗時相似的表型，即未表現出明顯的趨光性行為，但在藍光和紫外光照射的同時再給予額外的紅光的照射后，菌株孢囊梗彎曲率與藍光和紫外光雙光源照射條件下出現差異，紅光修飾了藍光和紫外光之間的相互作用，且幾乎完全抵消了二者之間的拮抗作用，這暗示著紅光受體中間體的存在［37］。其他研究表明madC突變體對藍光敏感性大大降低，而引入紅光刺激后在一定程度上恢復了基因缺失造成的敏感性變化的表型，這一研究結果也證實了紅光受體中間體這一猜想［38-39］。綜上所述，菌株對不同波譜范圍光信號的響應行為不同，以及組合光照條件下的趨光性變化，為該菌多種感應系統的存在提供了證據?；趯σ幌盗汹吂庑匀毕萃蛔凅w的研究表明，藍光受體蛋白MadA和MadB與趨光性的發生有關［16］，madC編碼的Ras GTP酶激活蛋白通過Ras信號通路對趨光性產生影響［40］，而madDEFGH五個基因不同程度地參與這個過程［41］。

2006年，首次報道了卷枝毛霉孢囊梗的趨光性現象，與布拉克須霉不同的是該菌株不僅對藍光和近紫外光表現出趨光性，對綠光（500-600 nm）刺激也表現出明顯的正趨光性，通過對mcwc-1缺失及回補突變體的趨光性的研究證實mcwc-1a基因調控了這一生理現象［18］，但具體的調控機制仍有待于進一步的研究。

除了布拉克須霉和卷枝毛霉外，接合菌中的水玉霉屬中也有關于趨光性現象的報道，并且趨光性與生理功能相適應。如水玉霉的孢囊梗在生長過程中趨向藍光方向并且孢子囊向光源方向爆裂噴射以促進孢子傳播［42］；晶澈水玉霉在照射藍光之后，其光注入量與孢囊梗的響應曲率發生相應變化，說明該菌株對光的感應是一個復雜的信號轉導系統，盡管3個wc1-like基因被識別鑒定，但其對不同光響應生理過程的調控目前仍然是未知的［43-44］。

2.2 誘導類胡蘿卜素合成

接合菌中的布拉克須霉、卷枝毛霉和三孢布拉氏霉（Blakeslea trispora）等接合菌在藍光條件下能大量生成β-胡蘿卜素，在類胡蘿卜素生物合成途徑中，由GGPP起始類胡蘿卜素的合成僅依賴于兩個關鍵的酶基因：carB（編碼八氫番茄紅素脫氫酶）和carRA/carRP（編碼雙功能的八氫番茄紅素合成酶-胡蘿卜素環化酶），這兩個基因共用一個啟動子并反向轉錄，其轉錄水平受到光誘導［45-49］。

在布拉克須霉中，光誘導β-胡蘿卜素合成的光劑量-響應曲線表明菌株具有響應不同閾值的兩套光響應系統，而作用光譜則暗示著該過程還涉及一個具有黃素生色基團的光受體系統的參與［50］。盡管早期研究提出了類胡蘿卜素光誘導合成的可能機制及其復雜性猜想，但目前關于這方面的少數研究結果仍然是基于madA和madB突變體［51］，這兩個突變體對菌株的所有光響應過程造成了嚴重影響，其中包括類胡蘿卜素合成，因此認為MadA和MadB光受體蛋白在類胡蘿卜素光誘導合成中發揮關鍵作用［16，34］。此外，體外實驗證實MAD復合物能夠與類胡蘿卜素合成的結構基因carB和carRA基因啟動子上游的APE元件結合，說明這個光受體蛋白通過直接調控類胡蘿卜素合成途徑關鍵基因的轉錄水平來誘導類胡蘿卜素的合成過程［52］，而在菌株中識別出cry-DASH基因是否參與調控該代謝過程尚不明確［26］。

在卷枝毛霉中也存在類似的現象，類胡蘿卜素的合成與carRP和carB基因光誘導轉錄密切相關［46］，mcwc-1c基因的缺失導致菌株僅有少量β-胡蘿卜素產生，類胡蘿卜素合成鏈的光誘導效應大大降低，而野生型菌株給予一定量藍光刺激后，carRP基因和carB基因的轉錄水平顯著提高，但相比mcwc-1c基因缺失菌轉錄水平提高滯后，這說明MCWC-1c是提高carRP和carB轉錄水平所必需的［18］。

此外，2000年Navarro等［53］從卷枝毛霉中分離得到的一個影響類胡蘿卜素光誘導合成的crgA基因（Carotenogenesis regulatory gene A），CrgA蛋白廣泛存在于真核生物中但其功能不明確，這類蛋白具有一個共同特征，即N端含有兩個獨立的鋅指結構域（RING-finger zinc-binding domain），其后是一個多出現在ATP依賴的蛋白酶LON的N端的LON結構域，這些結構特征也說明該蛋白屬于泛素連接酶家族［54］。CrgA蛋白表達缺陷的菌株中，類胡蘿卜素合成基因的轉錄水平和胡蘿卜素含量不僅在黑暗條件下有大幅提升，而且在光照條件下也發生了光誘導轉錄激活和胡蘿卜素產量提高的現象［55］，這充分說明CrgA在類胡蘿卜素生物合成過程中扮演著抑制蛋白的角色。同時光誘導類胡蘿卜素合成作用沒有被完全阻斷，說明還存在一個不依賴于CrgA的光響應信號傳遞途徑來調控類胡蘿卜素的合成。奇怪的是，過量表達CrgA導致卷枝毛霉類胡蘿卜素合成過程喪失了對光的依賴［53］，這個現象可能與該基因表達的翻譯后沉默機制有關。而對crgA和mcwc-1的雙基因敲除突變體的研究表明，CrgA和MCWC-1c對類胡蘿卜素合成的調控是兩個獨立的過程，目前研究認為CrgA作為E3泛素連接酶通過泛素化修飾相關轉錄因子而來調控類胡蘿卜素的光誘導合成，而MCWC-1b本身就存在泛素化修飾狀態，使之成為CrgA的可能靶向蛋白。但是，CrgA介導的MCWC-1b泛素化與蛋白降解無關，其單泛素化和雙泛素化修飾狀態可能是由于減少了WCC的形成，進而抑制了類胡蘿卜素基因的轉錄［54］。

2.3 調控無性孢子生成和有性發育

接合菌同時存在無性生殖和有性生殖，相較于其他大多數真菌不能有性生殖，這是其獨特性。無性生殖最常見的形式是在孢子囊中形成非運動的孢囊孢子，這種孢子借助外力完成無性繁殖過程；有性繁殖不如無性繁殖普遍，多發生在特定條件下，有性繁殖的方式也因菌種不同而異，由菌絲分化形成特殊的性細胞（器官）配子囊或由配子囊產生的配子來相互交配，形成有性孢子（接合孢子）。真菌有性孢子的形成是一個相當復雜的過程。研究表明，接合菌的無性生殖和有性生殖過程均受光的影響［34］。

布拉克須霉進行無性生殖時能夠產生兩種大小不同的孢子囊——大孢子囊和小孢子囊，藍光可以刺激大孢子囊的產生，抑制小孢子囊的產生［34］。Corrochano等［41］以小孢子囊的數目、大孢子囊的干重與光通量之間的關系來表征菌株的光形態建成，研究表明該菌的光形態建成是兩個S型的刺激-響應曲線的總和，隨后對madA和madB單缺陷和雙缺陷突變菌株的光形態發生分析發現，MadA和MadB并不是以簡單疊加的方式參與調控，而是存在明顯的正協同現象，而madC到madH的缺陷對該過程并沒有影響，這說明光受體蛋白參與了無性孢子的形成。此外，carA基因的缺失造成了與ΔmadA和ΔmadB相似的光形態建成缺陷表型，盡管β-胡蘿卜素的缺乏是造成這一表型的重要原因，CarA與β-胡蘿卜素之間的相互作用也是不可缺少的關鍵因素，富含β-胡蘿卜素的小脂蛋白液滴被認為作為光接收天線，為下游的光受體蛋白參與的調控過程提供必要的反應中心［41，56］。無獨有偶，卷枝毛霉和水玉霉的無性孢子生成也受到光信號調控［57］，在卷枝毛霉中，CrgA作為激活因子發揮作用，該基因缺失造成了氣生菌絲的生長缺陷并大幅度降低了光照條件下無性孢子的生成［58-59］，而這種缺陷可以通過過表達一個受MCWC-1b調控的NmrA-like蛋白MasA來彌補［20］。在CrgA蛋白參與的多個生理過程中，其與MCWC-1b不同修飾狀態的相互影響和共同作用，暗示CrgA介導的信號調控途徑可能與光誘導信號途徑有交叉［18，54］。

光除了對無性生殖的影響之外，Yamazaki等［60］在1996年就報道了光照條件抑制布拉克須霉有性發育的現象，350-410 nm的強光照條件能最大程度地抑制菌株的有性發育。布拉克須霉有“+”“-”兩種接合型，在兩種性別的菌株基因組上各發現一個交配型基因MAT的類似基因—sexP和sexM［61］，這兩個基因和信息素生物合成基因carS的轉錄都受到光的調控，依賴于MadA-MadB復合物的功能［62-63］。然而（-）株中MAD復合物缺陷后光對有性生殖的抑制現象仍然存在，（+）株MAD復合物的缺陷則對該過程沒有影響，這種菌株性別的差異暗示著有性生殖的光調控僅通過（+）株實現的，這說明，光響應蛋白參與有性生殖調控是獨立于目前體內其他的光調控蛋白系統［63］。

3 展望

絲狀真菌生命活動規律的研究對于次生代謝產物的開發和工業應用具有重要指導意義。光是絲狀真菌生命活動的重要信號，真菌通過感受光照強度、光照方向和光照周期等變化調控著自身的生理反應和應答來更好的適應環境，包括有性生殖過程和次級代謝產物合成等。光受體蛋白是真菌感應光信號的接收器，具有承上啟下的作用，負責將光信號轉變為化學和生物信號，啟動下游的分子應答。對光調控真菌生命活動機制的深入研究，不僅在理論上有所創新，更有利于在真菌工業發酵生產過程中科學理性的引入光的因素，提高代謝產物的合成量。絲狀真菌中接合菌雖然這方面的研究剛剛起步，但為我們提供了一個研究光信號調控理論的模式，該類真菌基因組一般存在多個white collar同源基因，目前通過功能缺陷突變體的研究確定了少數幾個光感受器蛋白的功能，從已有的研究結果可以推斷特異性的光受體蛋白參與了不同的光響應途徑。后續研究將會集中在如下方面：（1）隨著接合菌遺傳操作方法的突破，通過基因定點缺失等方法進一步闡明已發現的光受體蛋白的生理功能；（2）隨著更多物種全基因組測序的完成，將有可能從基因組范圍內鑒定出不同的WC蛋白調控的下游靶基因，闡明接合菌光感應-光傳遞-光效應完整的信號傳遞途徑；（3）對這些不同光受體蛋白途徑調控和信息流的獨立性及交叉影響也將是未來研究的重點，為深入研究光調控接合菌重要生命活動奠定基礎。

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