炎癥反應中巨噬細胞的Siglec-G分子對DAMPs和PAMPs的識別及調節作用

樊亞童，鄭鑒，肖俊，張學軍

（天津醫科大學免疫學系，天津300070）

免疫系統對“自我”和“非我”識別及其相關分子機制是當前免疫學研究的熱點問題之一。免疫細胞表面存在豐富的糖鏈結構，該結構與病原體表面的糖鏈結構存在較大差異。巨噬細胞中唾液酸結合性免疫球蛋白樣凝集素（Siglecs）是識別細胞表面糖鏈結構的重要受體，具有參與“自我”和“非我”識別和調節免疫細胞功能等多方面的作用。Siglec-G是Siglecs家族重要成員之一，通過識別含有唾液酸的糖鏈結構，參與細胞間相互作用，此外還可以識別內源性危險信號和病原微生物，在固有免疫和適應性免疫中發揮重要的調控作用[1-2]。DAMPs是組織或細胞受到損傷和低氧等因素刺激后釋放到細胞間或血液循環中的一類物質[3]；PAMPs則是病原體上的分子結構[4]。二者均被模式識別受體（PRR）識別引起免疫應答。巨噬細胞作為機體重要的免疫細胞參與免疫識別、免疫應答和免疫調節等多種免疫反應過程，然而Siglec-G在巨噬細胞的表達及其與免疫識別和免疫調節相關性尚有待進一步證明。本研究通過提取小鼠腹腔巨噬細胞，用HMGB1（具有代表性的DAMPs）與LPS（具有代表性的PAMPs）在體外刺激，探討在DAMPs和PAMPs存在下，巨噬細胞中Siglec-G的表達情況及其對炎癥反應的調控作用。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗對象C57BL/6野生型小鼠購自軍事醫學科學院實驗動物中心，Siglec-G基因敲除小鼠由中國醫學科學院曹雪濤教授惠贈。實驗小鼠均在天津醫科大學實驗動物中心繁育，所有的程序按照天津醫科大學實驗動物中心的操作規范流程進行。實驗時選用健康雄鼠，8～10周齡，體質量20～22 g。

1.1.2主要試劑和儀器巰基乙醇酸鹽購自美國BD公司，小鼠HMGB1蛋白（Fc標簽）購自北京義翹神州科技有限公司，LPS購自Sigma公司，Trizol購自美國Invitrogen公司，M-MLV逆轉錄試劑盒購自美國Promage公司,Real time PCR Master Mix（SYBR Green）購自 Roche公司，TNF alpha Mouse ELI SA Kit和IL-6 Mouse ELISA Kit購自美國eBioscience公司，PCR儀購自美國BIO-RAD公司，Real-timePCR儀（LightCycler?96）購自Roche公司。

1.2實驗方法

1.2.1小鼠腹腔巨噬細胞的提取和純化選取8周以上雄鼠，腹腔注射2 mL巰基乙醇酸鹽48 h后，處死小鼠，以無血清的DMEM培養液灌洗小鼠腹腔數次，收集得到的細胞懸液離心5 min（2 000 r/min），棄上清，收集細胞，1×PBS洗1遍，加入含10%FBS的DMEM培養液，在37℃、5%CO2孵箱中培養2 h后分離培養，用1×PBS沿培養板內壁沖洗細胞3至4遍，貼壁細胞為巨噬細胞，用含10%FBS的DMEM培養液繼續培養24 h后可做實驗。

1.2.2細胞培養與刺激方案 （1）提取野生型小鼠腹腔巨噬細胞，以適當細胞密度接種于6孔板中，置于37℃、5%CO2孵箱培養24 h后，棄掉細胞上清，用無FBS培養液繼續培養6至8 h后，棄去上清，換成含10%FBS的DMEM培養液，同時在培養液中加 10 μg/mL 的 HMGB1 刺激不同時間（0、3、6、12、18 h和24 h）后提取細胞RNA，檢測Siglec-G的基因表達；（2）提取野生型小鼠腹腔巨噬細胞，其余操作方法同上，最后用不同濃度的HMGB1（1、5和10 μg/mL）刺激24 h后提取細胞RNA，檢測Siglec-G的基因表達；（3）提取野生型小鼠腹腔巨噬細胞，操作方法同上，用100 ng/mL的LPS刺激不同時間（0、3、6、12、18 h和 24 h）后提取細胞 RNA，檢測Siglec-G的基因表達；（4）提取野生型小鼠腹腔巨噬細胞，操作方法同上，最后用不同濃度LPS（10、100和1 000 ng/mL）刺激24 h后提取細胞RNA，檢測Siglec-G的基因表達；（5）提取野生型和Siglec-G-/-小鼠腹腔巨噬細胞，以適當細胞密度接種于48孔板中，操作方法同上，最后用 HMGB1（10 μg/mL）和LPS（100 ng/mL）刺激24 h后收集細胞上清，檢測TNF-α和IL-6分泌情況。

1.2.3RNA的提取、逆轉錄反應和Real-time PCR用Trizol裂解細胞，振蕩并室溫靜置3 min后12 000×g離心15 min，吸取上層無色透明溶液并加入500 μL異丙醇混勻，室溫靜置 10 min后，12 000×g離心20 min，去掉上清，加入75%的乙醇洗滌沉淀兩遍，離心后棄上清，所得沉淀即為RNA，加入DEPC水溶解RNA，于56℃水浴10 min后放在冰上即可。用DEPC水適當稀釋RNA后，測定OD值，計算RNA純度及產量。根據Promega逆轉錄試劑盒說明逆轉錄合成cDNA，Real-time PCR采用 Roche的SYBR green染料說明指導，用LightCycler?96儀器檢測基因表達情況。Siglec-G正向：5′-TGGTCATCGTGAAGACCCTC-3′，反向：5′-TGAGCTCCTAGAAGGGGCAT-3′；β-actin 正向：5′-AGAAGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3′，反向：5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCACAT-3′。以上引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.4ELISA法檢測細胞上清TNF-α和IL-6分泌情況按照ELISA試劑盒操作說明進行，實驗前一晚包被捕獲抗體，轉天晨洗板3次，加入200 μL封閉液，室溫封閉1 h后洗板1次，加入100 μL待檢測細胞上清原液，室溫孵育2 h后洗板3次，加入100 μL檢測抗體，室溫孵育1 h后洗板5次，加入100 μL HRP，室溫避光孵育 30 min，洗板 5至 7次后加入顯色液，最后加入終止液在酶標儀上檢測。

1.3統計學方法各組實驗均獨立重復至少3次，用GraphPad Prism 7.0軟件對數據進行統計學分析，實驗數據以±sx表示，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05定義為差異有統計學意義。

2　結果

2.1DAMPs和PAMPs作用巨噬細胞后Siglec-G的基因表達情況應用HMGB1在不同時間點刺激野生型小鼠腹腔巨噬細胞，Real-time PCR檢測Siglec-G的基因表達情況。結果見圖1，隨著刺激時間的延長，Siglec-G的表達逐漸升高，尤其在第18 h和 24 h，其表達明顯高于對照組（P<0.001，P<0.01，圖1A）。應用不同濃度的HMGB1刺激巨噬細胞，結果發現隨著給藥濃度的增加，Siglec-G的表達量也明顯增高（P<0.001，圖1B）。而用LPS在不同時間點刺激巨噬細胞后，Siglec-G的表達沒有明顯升高（圖1C）。同樣地，用不同濃度的LPS刺激巨噬細胞，Siglec-G的表達也沒有升高（圖1D）。以上結果表明DAMPs能夠影響巨噬細胞中Siglec-G的表達，而PAMPs對Siglec-G的表達無明顯影響，說明Siglec-G可以特異識別DAMPs并具有時間和劑量依賴性。

栽培要點：河北北部、內蒙古全部在4月底5月初播種。播種前18～20天將種薯提前出窖以10cm厚度平鋪于暖室，18℃催芽12天，待芽基催至0.5～0.7cm時轉到室外曬種8天。切塊重30g左右，每個切塊確保1～2芽。切刀用0.4%高錳酸鉀溶液消毒，防止病害傳播。每畝種植3500～4000株。結合播種每畝施優質農家肥3000kg，混施馬鈴薯專用肥50kg；苗高20cm時中耕一次，現蕾前結合中耕培土一次，主要防治馬鈴薯早疫病和晚疫病。在現蕾期開始用藥，可以選擇50%烯酰嗎啉可濕性粉劑等藥劑交替使用，生育期共用藥3～5次。

圖1　巨噬細胞中Siglec-G的基因表達Fig 1　The expression of Siglec-G mRNA in macrophages

2.2DAMPs和PAMPs作用不同基因型小鼠巨噬細胞后TNF-α和IL-6的分泌情況為了觀察Siglec-G表達對DAMPs和PAMPs作用后巨噬細胞分泌炎性因子的影響，我們分別用HMGB1和LPS刺激野生型和Siglec-G-/-小鼠的巨噬細胞，ELISA檢測細胞上清中炎癥因子的分泌情況。結果見圖2，LPS刺激兩種基因型小鼠的巨噬細胞其分泌TNF-α沒有明顯變化（圖2A），而HMGB1刺激后，Siglec-G敲除的巨噬細胞分泌TNF-α明顯多于野生型小鼠的巨噬細胞（P<0.001，圖2B）。同樣地，LPS刺激兩種基因背景的巨噬細胞后，IL-6的分泌沒有變化（圖2C），HMGB1刺激后，Siglec-G敲除的巨噬細胞分泌IL-6明顯增多（P<0.01，圖2D）。以上結果表明，Siglec-G特異性抑制DAMPs誘導的巨噬細胞分泌促炎因子，而對于PAMPs引起的炎癥反應沒有影響，說明在巨噬細胞中Siglec-G是通過識別DAMPs來發揮免疫抑制功能。

圖2　巨噬細胞上清中炎癥因子的分泌情況Fig 2 The secretion of inflammatory cytokines in the supernatant of macrophages

3　討論

DAMPs和PAMPs作為特殊的抗原形式，參與宿主免疫細胞的免疫識別，是激活和啟動固有免疫應答和適應性免疫應答的必要條件。HMGB1被認為是一種細胞核內固有免疫危險信號，也是DAPMs的重要成員之一[5]，它能夠與特異性受體結合，誘導巨噬細胞分泌炎性細胞因子[6]。LPS為革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要成分，它屬于PAMPs，TLR4識別LPS后可直接激活NF-κB信號通路引發炎癥反應[7-8]。目前看來，DAMPs和PAMPs在固有免疫應答中的研究，尤其是樹突狀細胞相關的研究越來越多[1,9-10]，而在巨噬細胞中的研究還比較少。本研究發現，HMGB1刺激巨噬細胞后Siglec-G的表達明顯升高，而LPS刺激后其表達沒有變化，該結果提示Siglec-G特異性識別DAMPs模式分子，而對PAMPs模式分子沒有識別能力。

Siglecs作為一種免疫識別受體，它通過與細胞表面的多聚糖結合調控天然免疫和獲得性免疫反應，從而實現其抗病原體的功能[11]。Siglecs主要包括兩類:一類是序列保守的Siglecs，包括唾液酸黏附素、CD22和Siglec-15等；另一類是與CD33相關的序列可變的Siglecs，包括CD33，Siglec-E和Siglec-G等[11]。在這兩類型中，大多數成員的胞內段含有免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIMs），從而可以發揮免疫抑制功能[12-14]。Siglec-G作為CD33家族的一員，在免疫識別和免疫調控中發揮越來越重要的作用[15-16]。目前關于Siglec-G的研究主要聚焦在樹突狀細胞[1,17]，B細胞[18]和 T 細胞[19]。為了探討 Siglec-G 表達對巨噬細胞免疫活性的影響，我們利用Siglec-G敲除小鼠，DAMPs和PAMPs兩種模式分子分別誘導巨噬細胞活化，觀察Siglec-G分子對巨噬細胞分泌炎性因子的調節作用。筆者發現HMGB1作用于Siglec-G敲除小鼠的腹腔巨噬細胞后，TNF-α和IL-6等炎性因子的分泌水平明顯升高，但LPS刺激后，其表達在兩種基因背景的巨噬細胞中沒有差異，提示巨噬細胞可能是通過表達Siglec-G來識別胞內危險信號分子并發揮免疫抑制作用，而對病原相關蛋白分子，Siglec-G缺乏識別及調控作用。

鑒于巨噬細胞的異質性及其功能相關性，Siglec-G在不同免疫器官中巨噬細胞及其亞型的表達，Siglec-G是通過何種途徑來發揮免疫抑制功能和具體的作用機制如何尚有待深入研究。

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