缺氧預適應誘導人臍靜脈內皮細胞釋放的微囊泡對正常H9c2細胞的作用

劉超，韋蘇，張琨瑋，祝倩，李燁儀，榮玉美，趙俊玉，李無為，尚曼，宋君秋，吳燕娜，劉艷霞

（天津醫科大學藥理學系，天津300070）

目前臨床上治療心肌梗死的方法有經皮冠狀動脈介入治療、心臟冠狀動脈搭橋術、血栓溶解療法等。缺血的心肌組織在短時間內獲得血液再灌注和氧氣供應的同時也加重了心肌損傷即缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷，其損傷的主要原因是缺血導致的細胞缺氧和細胞酸中毒等[1]。心肌缺血預適應（ischemic preconditioning,IPC）是治療心肌I/R損傷的最具前景的方法[2]。目前心肌IPC作用的分子機制仍有待進一步完善。微囊泡(microvesicles，MVs)是由質膜直接脫落的直徑在100~1 000 nm的微小囊泡。當細胞自身生理發生改變或受到外來刺激，如組織缺血、氧化損傷、剪切力、細胞蛋白復合物的改變等，導致細胞內鈣超載，質膜失去平衡，細胞膜褶皺形成MVs釋放到細胞外[3-4]。本實驗室前期研究發現，大鼠IPC處理后，循環血中總MVs的含量明顯增加，且IPC-MVs通過線粒體和內質網兩種途徑顯著減輕心肌I/R損傷，MVs中內皮來源的MVs（EMVs）明顯增加，但內皮來源的MVs在IPC對心肌的作用是未知的[5]。由于動物水平的IPC模型受到多種體內體外因素的影響，造成了在體模型的不穩定，不能準確的反映生物活性物質的作用機制。因此本實驗體外細胞HPC模型模擬體內IPC，進一步探討EMVs對于心肌細胞的影響，了解IPC的作用機制，為臨床治療缺血性損傷提供策略。

1　材料和方法

1.1材料人臍靜脈內皮細胞(HUVECs，中國科學院細胞庫)，H9c2心肌細胞系 (ATCC)，胎牛血清，DMEM(高糖)，青鏈霉素混合液，MTT(Solarbio)，BCA法蛋白定量檢測試劑盒（Solarbio），Hoechst33258試劑盒，Caspase 3檢測試劑盒 (江蘇碧云天生物技術研究所)，LDH測定試劑盒 (南京建成生物工程研究所)，Bcl-2 抗體 (Santa Cruz)，Bax、β-actin 抗體(Cell Signaling Technology)。

1.2實驗方法

1.2.1HUVECs缺氧預適應（HPC）模型的建立細胞培養與實驗分組：HUVECs細胞以6×104個/mL的密度接種于96孔板中，于95%O2-5%CO2、37℃的孵箱中培養24 h，HUVECs分為3組，對照組、缺氧/復氧組（H/R）和HPC組。Control組棄去上清后加入200 μL pH 7.4的對照液，于95%O2-5%CO2、37℃孵箱中培養16h25min。H/R組和HPC組棄去上清后均加入100 μL pH 6.8的缺氧液，H/R組在于95%O2-5%CO2、37℃孵箱中培養25 min，與H/R組不同是，HPC組做短暫缺氧/復氧處理，即預先將細胞置于缺氧裝置中以20 L/min的流速通95%N2-5%CO2混合氣10 min，隨后將HPC組細胞放置于95%O2-5%CO2、37℃的孵箱培養15 min。H/R組和HPC組同時進行長時間的缺氧12 h/復氧4 h處理，即加入100 μL pH 5.8缺氧液，置于缺氧裝置中以20 L/min的流速通95%N2-5%CO2混合氣15 min達到平衡狀態后，于37℃的恒溫孵箱中進行長時間缺氧12 h的處理，處理完成后取出兩組細胞置于95%O2-5%CO2、37℃孵箱中復氧4 h。隨后采用MTT法檢測各組細胞存活率。

1.2.2HPC-EMVs的分離提取HUVECs接種于6孔板中，HPC處理后收集細胞及上清，采用兩步離心法收集HPC-EMVs：4℃，1 800 r/min，離心20 min去除細胞碎片；收集上清液于13.2 mL超速離心管中，4℃、33 000 r/min，超速離心150 min，得到的沉淀即為 HPC-EMVs，D-hank’s重選后于-20℃保存備用。

1.2.3HPC-EMVs的蛋白定量采用BCA蛋白定量法對HPC-EMVs進行蛋白含量的測定。將HPCEMVs樣品放置于冰上融化后混勻，取15 μL HPCEMVs加入30 μL的裂解液，冰上裂解30 min后混勻。參照試劑盒說明書對HPC-EMVs蛋白含量進行檢測。

1.2.4透射電鏡觀察HPC-EMVs的形態將HPC-EMVs樣本置于冰上自然融化，待其完全融化后混勻，取40 μL HPC-EMVs懸液滴在銅網上，室溫靜置2 min，將多余的液體用濾紙從側面吸去。滴入等量的2%磷鎢酸染色液到未完全干的載網，室溫放置2 min，將多余的液體用濾紙從側面吸去。白熾燈照射使其干燥，并在透射電鏡下觀察，選擇合適的視野和放大倍數進行拍照。

1.2.5HPC-EMVs和正常H9c2細胞共孵育將H9c2細胞以1×105個/mL的密度分別接種于培養板中，于95%O2-5%CO2、37℃孵箱中培養24 h。棄去培養液，對照組換用無FBS高糖DMEM培養基，HPC-EMVs各組換用預先用DMEM培養基配制的濃度為 10、30、60 μg/mL 的 HPC-EMVs 懸液，于95%O2-5%CO2、37 ℃孵箱中孵育 4 h。

1.2.6MTT法檢測細胞存活率取各組處理完成的細胞，每孔加入0.5%MTT溶液10μL，放入37℃培養箱中繼續培養4 h后取出，吸凈孔中液體，每孔加入150 μL DMSO，將培養板置于酶標儀中，調節波長為490 nm，震蕩10min，檢測各孔吸光度。按照OD檢測組/OD對照組×100%的公式計算細胞存活率。

1.2.7比色法測定培養液中LDH活性分別取各組H9c2細胞培養液，參照試劑盒說明書采用比色法對培養液中LDH活力進行檢測，LDH活性（U/L）=（測定孔吸光度-對照孔吸光度)/(標準孔吸光度-空白孔吸光度）×標準品濃度（0.2 mmol/L）×1 000。

1.2.8Hoechst 33258染色法檢測細胞凋亡DHank’s洗滌各組H9c2細胞2次，每孔加入Hoechst 33258 染色液 1 mL，室溫染色 30 min，D-Hank’s洗2~3次以去除染液，設置顯微鏡激發波長為340 nm，選擇合適的視野觀察細胞形態并拍照。

1.2.9比色法測定Caspase 3活性吸取各組細胞培養液，備用。收集細胞于離心管中。在4℃的條件下，400 r/min，離心5 min，小心吸去上清，用D-Hank’s洗滌1次后再次離心。吸盡上清后，6孔板每孔加入含1 mmol PMSF的裂解液100 μL，混勻后，冰上裂解30 min。4℃，8 000 r/min，離心15 min提取蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，參照試劑盒說明書使用微量酶標儀讀取405 nm處吸光度，繪制標準曲線，計算樣品中Caspase 3活性。

1.2.10Western blot檢測Bcl-2/Bax蛋白的表達收集H9c2細胞后加入Western及IP裂解液100 μL，混勻后于冰上裂解30min。4℃，8000r/min，離心15min收集蛋白，蛋白定量后取適量蛋白電泳并轉移至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，并在其中加入Bcl-2（1∶1 000）、Bax 抗兔一抗（1∶1 000）和 β-actin（1∶1 000）抗兔一抗，4℃孵育過夜，一抗孵育結束后用TBST于搖床上洗膜，每次10 min，共3次。將PVDF膜封于新的雜交袋中，并加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗IgG（1∶1 000），室溫搖動孵育2 h，孵育結束再次洗膜。加入Bcl-2和Bax抗兔一抗（1∶1000），化學發光成像儀拍攝蛋白條帶，圖像利用Image J軟件計算Bcl-2、Bax灰度值，并計算兩者比值。

1.3統計學處理使用SPSS 17.0軟件對測定結果進行分析，組間比較使用單因素方差分析檢驗，對于單因素方差分析，方差齊時，采用多組間比較LSD法；方差不齊時，采用Tamhane’s T2法。檢驗以P<0.05為有統計學意義。結果以±s表示。

2　結果

2.1成功建立HUVECs HPC模型與對照組相比，H/R組細胞存活率在70%左右，說明H/R造成細胞損傷且損傷程度適中，與H/R組相比，HPC組細胞存活率較H/R組顯著升高（94.83%±2.55%vs 75.98%±4.54%，P<0.01）（圖 1），說明 HPC 發揮了抗H/R損傷的作用，實驗結果穩定且重復性好，故成功建立HUVECs的HPC模型。

圖1　H/R和HPC模型中HUVECs存活率(n=6,±s)Fig 1　The cells viability of HUVECs in H/R and HPC model(n=6,±s)

2.2HPC-EMVs的蛋白含量和形態HPC-EMVs的蛋白定量：通過BCA法標準曲線的公式計算出HPC-EMVs的蛋白含量為（0.298±0.045）μg/μL。HPC-EMVs的形態：負染法處理MVs后，在透射電鏡下，選定放大倍數為6 000倍，結果發現HPCEMVs直徑在100~1 000 nm，形狀為圓或橢圓形，且具有和細胞相似的膜結構，有完整的包膜，未見明顯細胞器結構（圖2）。

圖2　透射電鏡下HPC-EMVs的結構(負染法，×6.0 K)Fig 2　The structure of HPC-EMVs under transmission electron microscopy(negative dyeing method,×6.0 K)

2.3HPC-EMVs對H9c2細胞的損傷作用MTT檢測發現，與對照組（100%±0%）相比，HPC-EMVs 30組（90.43%±1.21%）和HPC-EMVs 60組（73.19%±2.11%）細胞存活率明顯下降（P<0.001），但 HPCEMVs 10組的細胞存活率（96.31%±1.84%）并無統計學差異；與HPC-EMVs 10組相比，HPC-EMVs 30和60組細胞存活率顯著下降 （P<0.01或P<0.001）；與 HPC-EMVs 30組相比，HPC-EMVs 60 組細胞存活率亦顯著下降（P<0.001）。由此可見，隨HPC-EMVs濃度增大，H9c2細胞存活率逐漸下降，且差異具有統計學意義，見圖3A。

LDH檢測顯示，與對照組（116.23 U/L±6.88 U/L）相比，HPC-EMVs 30 組（132.97 U/L±4.92 U/L）、60組(157.38 U/L±6.94 U/L)LDH活性顯著升高（P<0.01或P<0.001），但HPC-EMVs10組的LDH水平（114.25U/L±6.31 U/L）略有降低并無統計學差異；與HPCEMVs 10組相比，HPC-EMVs 30和60組LDH活性顯著增加（P<0.001）；與HPC-EMVs 30組相比，HPC-EMVs 60組LDH活性亦顯著增加（P<0.001）。LDH活性隨HPC-EMVs濃度的增加呈劑量依賴性顯著性增加，見圖3B。2.4HPC-EMVs對H9c2細胞的促凋亡作用及相關機制Hoechst33258染色結果顯示，對照組細胞形態規則完整，細胞核染色均勻一致。HPC-EMVs處理后，HPC-EMVs 10組H9c2細胞可見個別細胞核出現固縮凝聚，呈致密濃染；HPC-EMVs 30組凝聚的細胞核稍增多；HPC-EMVs 60組細胞核固縮濃染明顯增多，細胞核分裂成碎片，胞核致密濃染，即凋亡細胞數目增加，見圖4A。

Caspase 3活性檢測結果顯示，與對照組（140.04 U/μg±10.37 U/μg） 比較，HPC-EMVs 60 組Caspase 3 活性顯著升高（307.29 U/μg±9.25 U/μg，P<0.001)；與 HPC-EMVs 10（142.51 U/μg±10.55 U/μg）和 HPC-EMVs 30 組（182.78 U/μg ±6.58 U/μg）比，HPC-EMVs60組Caspase3活性也有顯著增高（P<0.001），見圖4B；Western blot檢測顯示，與對照比，HPCEMVs各組隨MVs濃度增大，Bcl-2的條帶逐漸變淺，HPC-EMVs 60組條帶幾乎消失，Bax的條帶逐漸加深，Bcl-2/Bax比值降低，見圖4C。

圖3　A.HPC-EMVs對正常H9c2細胞存活率的影響(n=6,±s)B.HPC-EMVs對正常H9c2細胞培養上清液LDH活性的影響(n=6,±s)Fig 3 A.Effects of HPC-EMVs on normal H9c2 cell viability(n=6,±s)B.Effects of HPC-EMVs on LDH activity in supernatant of normal H9c2 cells(n=6,±s)

圖4　A.HPC-EMVs對正常H9c2細胞Hoechst染色的影響(×200);B.HPC-EMVs對正常H9c2細胞Caspase 3活性的影響(n=6,±s)；C.HPC-EMVs對正常H9c2細胞Bcl-2/Bax蛋白表達的影響(n=3,±s)Fig 4 A.Effects of HPC-EMVs on Hoechst staining in normal H9c2 cells　(×200);B.Effects of HPC-EMVs on the activity of Caspase 3 in normal H9c2 cells(n=6,±s);C.Effects of HPCEMVs on the protein of Bcl-2/Baxin normal H9c2 cells(n=6,±s)

3　討論

血管內皮功能紊亂作為心肌缺血損傷的起始環節，其與IHD的發生發展密切相關。IPC指的是短暫的剝奪特定器官或組織的血液供應后，給予短時間的再灌注的處理，進而對后續的長時間的缺血/再灌注損傷發揮保護作用[6]。心肌缺血/再灌注損傷常伴發嚴重的心肌損傷，心肌細胞出現不可逆性的凋亡和壞死。實驗室前期發現，來自H/R處理的人臍靜脈內皮細胞的微泡促進H9c2心肌細胞的凋亡和氧化應激[7]。本研究證實HPC-EMVs對正常H9c2心肌細胞有損傷作用，并發現其通過降低H9c2細胞的抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的比值，增加Caspase 3活性發揮作用。

將細胞進行缺氧處理，是最接近在體缺血過程及機制的細胞模型[8-9]。本實驗室前期在細胞水平選用酸性的缺氧液模擬I/R損傷時的細胞酸中毒以及通入N2-CO2混合氣模擬細胞缺氧時的無氧環境建立了I/R損傷模型并達到了良好的損傷程度和重復性，為內皮細胞的HPC模型提供了前提[7]。因此本實驗采用體外的細胞缺氧預適應模型，探索內皮細胞來源的MVs在HPC過程中的作用機制。

Caspase家族主要在凋亡的執行階段起主要作用，凋亡的發生是一系列Caspase家族成員共同參與完成的。其中，Caspase 3被認為是各種凋亡刺激因子激活的Caspase家族中的關鍵蛋白酶。Caspase 3可被該家族其他成員活化，引起DNA損傷修復酶降解，同時激活核酸內切酶，從而使細胞凋亡[10]。Bcl-2家族是細胞凋亡基因之一，其中Bcl-2是原癌基因，Bcl-2可抑制細胞凋亡，而Bax的作用正好相反，Bax的表達或過表達，可促使細胞凋亡，Bcl-2/Bax的比值將決定細胞是否發生凋亡[11]。本實驗室前期研究發現IPC-MVs對I/R大鼠心肌具有保護作用，并證明其機制為上調I/R心肌組織中Bcl-2的蛋白表達，下調Bax的蛋白表達，降低Caspase 3活力[12]；本研究進一步證實HPC-EMVs同樣通過下調H9c2心肌細胞中Bcl-2的蛋白表達，上調Bax的蛋白表達，下調Bcl-2/Bax的比值，升高Caspase 3活力發揮促凋亡作用。

本研究發現HPC-EMVs對正常培養的H9c2有促進凋亡的作用，原因有如下幾點：首先，在MV的提取時間方面，本研究對HUVECs進行短暫缺氧/復氧后又進行了長時間的缺氧/復氧處理，最終提取的MVs，不排除在長時間的缺氧/復氧中，產生了損害性的MVs的可能。其次，在MVs的作用效果方面，本實驗前期發現IPC-MVs對于正常的H9c2細胞有促進凋亡的作用，但對于H/R損傷的心肌細胞有保護作用，即MVs發揮了雙向的作用?？傊?，血管內皮功能障礙是與缺血性心臟病密切相關的決定因素。然而內皮MVs對心肌損傷的潛在貢獻尚不清楚，探索MVs的作用機制成為目前的重點。

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