復合鎂基磷酸鹽骨水泥的研究

張芝祥，楊在君,b，顏紅海，丁 祥,c，黃雨裳，周萍萍，黎云祥,c

(西華師范大學 a.組織修復材料工程技術協同創新中心；b.生命科學學院；c.環境科學與工程學院，四川 南充 637009)

不規則的骨缺損和骨損傷一直是當今外科手術的一個難題[1-2]。當前，臨床上主要借助骨移植以及骨修復材料填充等方法達到骨修復和重建的目的[3]。盡管骨移植具有良好的生物相容性以及誘導性，但由于來源有限等缺點難以用于大規模的骨損傷修復[4]，因此骨修復材料是解決這一難題的關鍵。目前，臨床上應用較多的具有生物活性的骨修復材料主要是磷酸鈣類材料(calcium phosphate cement，CPC)。CPC具有良好的生物相容性和誘導性，并表現出較好的力學性能，然而CPC中的鈣磷比過高，導致其在體內降解緩慢且無粘結性[5-6]。

近年來，鎂基磷酸鹽骨水泥(magnesium phosphate cement，MPC)獲得了人們廣泛關注。相比CPC，MPC除具有優良的生物相容性和誘導性，還具有較高的起始強度、較快的硬化速度、以及適當的降解速度，且MPC降解過程中釋放的Mg2+能夠促進成骨細胞生長[5,7-8]。傳統MPC主要是鎂基磷酸銨鹽骨水泥(magnesium ammonium phosphate cement，MAPC)，是通過添加高溫煅燒后的MgO和NH4H2PO4做為固相，進一步水化反應生成MgNH4PO4·6H2O[5,8]。這個過程中會釋放大量NH3，而體內過量的NH3可能引起較強的細胞毒性，增加機體負擔[8-9]。同時，鎂基磷酸銨骨水泥凝固時間過快(約3min)[9]，從而限制了其在骨組織修復上的應用。鑒于此，相關研究利用KH2PO4代替NH4H2PO4做為固相合成鎂基磷酸鉀骨水泥(magnesium potassium phosphate cement，MKPC)取得了較好效果。相比NH4H2PO4，KH2PO4具有較低的解離常數和溶解性，從而降低了反應速率，使凝固時間得以延長[8]。同時反應過程中無可能對機體造成負擔的物質產生[9]。然而，KH2PO4代替NH4H2PO4使得制備的水泥起始強度下降[10]，仍然不利于臨床上應用。因此，作者嘗試通過同時使用NH4H2PO4和KH2PO4作為骨水泥主料合成一種新型生物相容的、可降解的復合鎂基磷酸鹽骨水泥(composite magnesium phosphate cement，CMPC)，并對合成的復合鎂基磷酸鹽骨水泥抗壓強度、表觀形貌、降解能力進行表征，進而探索該復合鎂基磷酸鹽骨水泥應用于骨組織修復的可能性。

1　材料與方法

1.1　材　料

CMPC固相主要由MgO、NH4H2PO4、KH2PO4、羥基磷灰石等組成。液相為含有NaCl和磷酸鹽的磷酸溶液。其中磷酸鹽可以中和磷酸溶液，起到pH調節和緩沖作用。MgO購自河北邢臺冶金鎂業有限公司，NH4H2PO4、KH2PO4購自湖南九典制藥有限公司，羥基磷灰石由四川大學生物材料工程研究中心提供。其余試劑均購自成都科龍化工試劑廠。MgO使用前采用1 600 ℃高溫進行煅燒從而降低反應活性。煅燒后的氧化鎂、以及所使用磷酸鹽均采用尼龍篩(300目)進行過篩處理。為探討復合鎂基磷酸鹽骨水泥應用于骨組織修復的可能性，選擇已上市銷售MAPC和MKPC做為參照進行相關性能測試。

1.2　骨水泥樣品制備

將制備骨水泥所用固相及液相以0.1～0.5 mL/g的比例進行混合、攪拌成勻漿。待攪拌均勻后，用注射器將骨水泥勻漿注入底面直徑為5 mm，高為10 mm的圓柱形玻璃模具中成型，制備細胞毒性測試及生物降解性能測試樣品。隨后將模具置于37 ℃恒溫箱中固化24 h?？箟簭姸葴y試樣品采用底面直徑為6 mm，高為10 mm的圓柱形玻璃模具中成型。為了降低環境溫度對實驗結果的影響，實驗室設置為恒溫(25 ℃)。

為了探尋最適CMPC合成配比，本研究采用正交試驗，以固化液濃度、氨/鉀比例、磷/鎂比例作為三個因素，進行三水平正交試驗，選擇正交表L9(34)安排實驗方案(表1)，對結果進行極差分析，確定最適配比條件。

作為對比的市售MAPC和MKPC樣品制備參照其使用說明進行配制，并注入底面直徑為5 mm，高為10 mm的圓柱形玻璃模具中成型，隨后在37 ℃恒溫箱中固化24 h備用。

表1　骨水泥正交實驗設計

注：體外細胞毒性等級根據GB/T16886.5—2003進行劃分。

1.3　體外細胞毒性測試

采用噻唑藍比色法(MTT)[11]評估CMPC體外細胞毒性。將制備的骨水泥樣品稱重后置于50 mL無菌離心管中，按0.2 g/mL比例添加RPMI 1 640細胞培養液，隨后將離心管置于37 ℃恒溫培養箱中靜置24 h進行浸提。浸提完成后，取浸提液上清液，過濾備用。將1×104/mL L929細胞懸液(參照GB/T14233.2—2005)接種于96孔無菌細胞培養板，每孔加入100 μLRPMI 1 640細胞培養液，置于CO2體積分數為5%的37 ℃恒溫細胞培養箱中培養24 h。培養結束后，棄去培養板內RPMI 1 640細胞培養液，加入200 μL樣品浸提液?？瞻讓φ談t加入等體積的RPMI 1 640細胞培養液。隨后置于恒溫細胞培養箱中(37 ℃，CO2體積分數5%)培養24 h。每個樣品重復6次。細胞培養結束后，取出細胞培養板，棄去培養板內樣品浸提液，于每孔中加入100 μL含血清10%的RPMI 1 640細胞培養液，同時加入1 mg/mL MTT染色劑50 μL，隨后再次置于上述細胞培養箱內培養3 h。培養結束后，棄去孔內液體，加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO)，震蕩10 min，檢測570 nm波長下樣品吸光度。按以下公式計算相對細胞增殖率，相對細胞增殖率=(實驗組吸光度值/空白組吸光度值)×100%。同時，觀察細胞在各組中生長情況及形態變化。

1.4　骨水泥性能測試

細胞毒性測試完成后，根據GB/T16886.5—2003對細胞毒性的等級劃分，對無毒樣品(毒性等級為1或0級)的抗壓強度、表觀形貌、降解能力進行表征，并選擇市售MAPC和MKPC做為參照進行對比。

1.4.1骨水泥組成及形貌特征分析

骨水泥組成采用X衍射(X-ray diffraction，XRD)分析。將骨水泥樣品碾碎，采用“壓片法”制成試片上機分析。X射線衍射分析在Dmax/UItima IV型X射線衍射儀(日本理學公司)上完成。通過對樣品衍射圖與PDF卡片對比得到樣品組成。骨水泥樣品形貌特征通過掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)進行分析。分析前，將骨水泥樣品制備成薄壁方塊狀試樣，在橫截面鍍金，隨后利用JSM-6530LV型掃描電鏡(日本理學公司)進行分析。加速電壓和加速電流分別設定為5 kV 和10 μA。

1.4.2抗壓強度測試

將制備的骨水泥樣品置于水溫37 ℃、100%濕度的恒溫水浴鍋中水化24 h。取水化后的試樣，將其兩段磨平，平衡度誤差0.01 mm。隨后利用MTS E44.104型微機控制電子萬能實驗機進行抗壓強度測試，加載速度設置為1 mm/min。每個樣品重復3次。

1.4.3生物降解性能測試

將骨水泥樣品稱重后置于塑料瓶中，并按200 mL/g比例添加Tris-HCl溶液(pH 7.4)。隨后將塑料瓶放置在37 ℃恒溫水浴搖床上(100 r/min)連續培養。每隔7d將骨水泥樣品取出，用去離子水清洗骨水泥樣品，置于120 ℃烘箱中烘干至恒重稱量并記錄，隨后置換新的Tris-HCl進行培養。骨水泥樣品降解率按如下公式進行計算：降解率(%)=(初始重量-剩余重量)/初始重量×100%。為了比較不同骨水泥不同時間段的降解速率，以7 d作為一個周期，計算周降解率。周降解率計算公式為：周降解率=每周降解骨水泥重量/骨水泥樣品初始重量×100%。

2　結果分析

2.1　影響鎂基磷酸鹽骨水泥細胞毒性的因素

觀察各組細胞生長狀況(圖1 A-J)發現，加入編號為1、4、5、9骨水泥樣品浸提液的細胞大量圓縮(圖1A、D、E、I)，加入編號為2、3、6、8骨水泥樣品浸提液的細胞大量破裂死亡(圖1B、C、F、H)。加入編號為7骨水泥樣品浸提液的細胞生長良好(圖1G)，細胞呈梭形且飽滿，與空白對照(圖1J)組細胞生長情況相似。利用MTT法對不同用料配比骨水泥的細胞毒性進行評估，并依據GB/T16886.5—2003分類標準對骨水泥樣品細胞毒性進行等級劃分(表1)，結果表明，除7號骨水泥樣品為無毒級外(相對細胞增殖率為97.55±4.06%)，其余樣品均表現為一定的細胞毒性。進一步對相對細胞增殖率結果進行極差分析(表2)，結果表明骨水泥中磷/鎂比例對骨水泥細胞毒性影響最大，固化液濃度次之，氨/鉀比例對骨水泥細胞毒性影響最小。具有最好生物相容性的骨水泥制備條件為固化液濃度為15%、氨/鉀比1.5、磷/鎂比為1.0。

2.2　XRD及SEM分析

進一步對CMPC樣品以及市售MPC的組成和形貌特征進行表征。XRD結果表明(圖2)，MKPC主要生成MgKPO4·6H2O，MAPC主要產物為MgNH4PO4·6H2O，而CMPC中包含上述兩種產物。同時，可以看出，MgKPO4·6H2O和MgNH4PO4·6H2O具有重疊的衍射峰。此外，三種骨水泥中均檢測到MgO的衍射峰，表明有大量未完全反應MgO存在。SEM掃描分析(圖3)展示了三種不同骨水泥截面形貌。MKPC表面呈塊狀且有大量圓形微孔和裂隙，放大掃描倍數發現，骨水泥呈表面覆蓋小顆粒的球形(圖3A)；MAPC表面光滑，存在大量微小裂縫，擴大掃描倍數發現，這些微小裂縫中存有大量微小球形顆粒(圖3B)；CMPC表面光滑有圓形微孔，進一步擴大掃描倍數發現，微孔中有著大量微小球形顆粒(圖3C)。

表2　CMPC體外細胞毒性極差分析

項目液相濃度/%鎂/磷氨/鉀K1-3131.57170.51166.11K4-6157.6186.140145.18K7-9183.75216.29162.19R17.39043.2906.9800

注：Ki為表1對應的各因素同一水平下每三組

試驗細胞相對增值率之和。

2.3　抗壓強度

對三種骨水泥的抗壓強度進行測試。結果表明(表3)，MKCP的抗壓強度最高，達到19.0±5.0 Mpa，CMPC的抗壓強度次之，為9.3±1.7 Mpa，MAPC的抗壓強度最低，僅為4.6±0.5 Mpa。

表3　三種鎂基磷酸鹽骨水泥抗壓強度

2.4　生物降解性能測試

對三種不同骨水泥生物降解性能進行測試。連續培養三周后，三種骨水泥的降解率均超過90%(表4)，培養至第四周時，已經完全降解。進一步分析發現，經過一周培養后，MKPC降解速率最快，為43.89%，CMPC次之，為36.66%，MAPC降解速率最慢，為25.67%；二周后，CMPC和MAPC降解速率仍然較快，分別為32.23%和32.42%，而MKPC降解速率有所下降，為22.01%；三周后，CMPC降解速率最快，達到45.26%，而MAPC和MKPC降解速率與上周基本持平，達到平衡，分別為32.72%和24.20%。

表4　三種鎂基磷酸鹽骨水泥生物降解性能

3　討　論

良好的生物相容性是骨水泥應用于臨床的首要條件。作者采用不同的骨水泥用料配比和極差分析，結合細胞形態觀察分析了影響復合鎂基磷酸骨水泥生物相容性的因素。結果表明(圖1，表2)，磷/鎂比是影響骨水泥生物相容性的首要因素。研究表明，鎂基磷酸骨水泥中的主要化學反應為：MgO+ KH2PO4(NH4H2PO4)+5H2O→MgKPO4·6H2O(MgNH4PO4·6H2O)[8]，反應過程中過多的磷酸鹽或氧化鎂會導致機體局部磷或鎂離子濃度過高，從而對機體產生毒害，使細胞不能正常生長[12]。研究結果也表明磷/鎂比為1.0時細胞具有最好的相對增殖率，這也證實了過多的磷或鎂離子可能不利于細胞生長，從而影響組織愈合。

為了進一步探討制備的骨水泥在組織修復上應用的可行性，作者根據細胞毒性結果對無毒的骨水泥樣品的抗壓強度、表觀形貌、降解能力進行了表征，并選擇市售鎂基磷酸鹽骨水泥進行對比。XRD結果表明，MKPC的主要產物為MgKPO4·6H2O，而MAPC的主要化學產物為MgNH4PO4·6H2O，這與前人的研究結果一致[8]。本研究合成的CMPC則檢測到上述兩種產物的衍射峰，說明CMPC中同時發生了這兩種主反應。研究表明，MgKPO4·6H2O與MgNH4PO4·6H2O具有相似的晶體結構[13]。本研究中，XRD結果顯示MgKPO4·6H2O與MgNH4PO4·6H2O衍射峰發生重疊，這再次證實了二者在晶體結構上的相似性。從抗壓強度來看，MAPC的抗壓能力最差，MKPC的強度最高，而本研究制備的CMPC抗壓強度居中。從SEM掃描結果(圖4)可以看出MAPC表面存在許多微孔，這些微孔可能是在化合反應中生成的氨氣逸出產生，致使骨水泥致密度變低，從而影響抗壓強度。值得注意的是，三種骨水泥中抗壓強度均低于30 MPa，僅能用于非承重骨修復[14]。有研究表明，MPC的抗壓強度主要由水化物和水泥石生產量決定，隨著MgO含量的增加，骨水泥的強度隨之增強[6]，鎂/磷摩爾比為4～5時，骨水泥強度最高[15]。然而，過量的Mg2+會增加骨水泥的細胞毒性，因此如何增加骨水泥強度而保持良好的生物相容性是骨水泥進一步應用于承重骨修復的關鍵。進一步對三種骨水泥的生物降解性能進行測試，結果顯示三周后三種骨水泥的生物降解率均超過90%，這表明這三種骨水泥均具有良好的生物降解能力。MAPC前期生物降解速度較慢，MKPC前期降解速度則較快，而CMPC的前期降解速率居中，這可能與骨水泥的組成相關。三種骨水泥在后期的降解速率則變化不大，表明達到某種平衡。這些結果說明可以通過選擇不同磷酸鹽及磷酸鹽組合作為骨水泥的磷酸鹽組分，從而合成具有不同初始降解速率的骨水泥材料，進而滿足不同的臨床要求。

綜上所述，通過同時添加NH4H2PO4和KH2PO4作為骨水泥磷酸成分，成功合成一種新型的骨水泥材料。通過正交設計研究了不同骨水泥組分對骨水泥生物相容性的影響，結果表明，磷/鎂比對骨水泥的體外細胞毒性具有重要影響，因此，在進行骨水泥制備時，要重點考慮磷/鎂比例。通過與市售MPC比較，本研究合成的新型骨水泥具有良好的生物相容性、優良的生物降解性能、以及較好的抗壓強度，有望應成為一種新型的骨組織修復材料。

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