基于線粒體D-loop DNA序列的甌江口鰻鱺幼苗遺傳鑒定

付秀蘭，謝斐昂，LUSANA James,3，陳永久,，李德偉，蔣日進

(1.國家海洋設施養殖工程技術研究中心，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學海洋科學與技術學院，浙江舟山 316022；3.Department of Aquatic Science and Fisheries Technology，University of Dar es Salaam，Dar es Salaam 35064，Tanzania；4.浙江海洋大學海洋與漁業研究所，浙江省海洋水產研究所，農業部重點漁場漁業資源科學觀測實驗站，浙江省海洋漁業資源可持續利用技術研究重點實驗室，浙江舟山 316021)

在分類學上,鰻鱺隸屬于硬骨魚綱Osteichthyes、鰻鱺目Anguilliformes、鰻鱺科Anguillidae、鰻鱺屬Anguilla。鰻鱺是一種逆河降海的洄游性魚類，成鰻在海中產卵，卵孵化后隨洋流遷移到江河口附近索餌。日本鰻鱺Anguilla japonica是廣泛分布于日本北海道至菲律賓之間的西太平洋18種鰻魚之一[1]，其神秘的生活史過程，復雜的繁殖生物學特征以及獨特的幼魚形態特征使人們對其產生濃厚的興趣[2]。日本鰻鱺是一種具有重要經濟價值的魚類[3]，特別在東亞是一類很受大眾喜愛的海產品。近年來，由于過度捕撈，棲息地破壞，入?？谖廴?，以及氣候變化等人為因素導致日本鰻鱺種群數量從1970年到2003年下降了大約90%，現今形勢還尤為嚴峻[4]。因此，開展相關研究來維持和保護日本鰻鱺種群勢在必行[5]。

甌江口地處東海南部近海，該海域是魚類索餌、產卵、繁育的良好場所，具有豐富的漁業資源。歷史上，甌江口是鰻苗的主要產地，上世紀70年代以前浙江省年產鰻苗3000多t，占全國產量3成以上[6]。近年以來，由于水利工程建設，環境污染和過度捕撈等因素，鰻苗資源總體上呈現衰退的趨勢。

為了更好地對漁業資源進行管理和保護，開展種質資源鑒定尤為重要。鰻鱺線粒體DNA控制區(control region或稱D-loop)具有較高的多態性，可以有效地揭示鰻鱺屬內種間、甚至種內群體間的遺傳變異[7-9]。本研究采用線粒體D-loop DNA序列對浙江甌江口鰻鱺幼苗進行遺傳鑒定，以期為漁業資源管理者及政策制定者提供基礎資料參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究的鰻鱺幼苗樣本于2017年3月從浙江溫州甌江口及鄰近水域采集。采樣地點北至清江河口，南至鰲江河口，西至楠溪江，東至洞頭列島，共包括6個采樣點：楠溪江、清江、鰲江、飛云江、洞頭和甌江，具體采樣地點如圖1所示。樣本采用95%酒精固定后帶回實驗室，置于-20℃冰箱中保存備用。

圖1 甌江口玻璃鰻的采樣信息Fig.1 The sampling information of glass eel in the Oujiang River estuary

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取

DNA序列分析樣品包括34尾玻璃幼鰻，全長均為55 cm左右。此外，還有1尾成年日本鰻鱺樣本采自于甌江。采用DNeasyR血液和組織試劑盒(Qiagen，Valencia，美國)從鰻魚尾鰭中提取基因組DNA，操作方法按照試劑盒說明。提取的DNA經過瓊脂凝膠電泳檢測后置于-20℃冰箱中保存備用。

1.2.2 PCR擴增和DNA測序

用于PCR的正、反向引物分別為L15625-CR 和 H84-CR[8]。PCR 采用 25 μL反應體系，包括 12.5 μL GoTaqRGreen Master Mix(Promega，美國)，正、反向引物(10 μM)各 2 μL，2 μL DNA模版，8.5 μL無菌超純水。PCR程序：95℃預變性2 min，然后95℃變性30 s，52℃退火40 s，72℃延伸90 s，共35個循環，最后72℃再延伸10 min。采用1.5%的瓊脂糖電泳檢測PCR產物的濃度和純度，PCR產物檢測陽性后送至上海生工生物技術有限公司，采用ABI-PRISM 3730進行測序。

1.3 數據處理分析

采用Sequencher 5.4(Gene Codes)和BioEdit V.7.0.4.1[10]軟件將測序結果進行檢查、校正和序列比對。將校正、比對后的序列文件保存為“fas”類型文件。通過BLAST工具(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)將所得的DNA序列在GenBank中進行相似性檢索，得出物種的分類地位。使用DnaSP 5.0軟件[11]計算DNA序列中的多態位點數(S)，單倍型多態性(Hd)、核苷酸多態性(π)，及單倍型間平均堿基差異數(k)，進行Tajima’s D 的中性檢驗，并分析核苷酸錯配分布(Mismatch distribution)。采用Arlequin 3.5[12]進行分子方差分析(AMOVA)，并計算采樣點之間的FST值。最后，采用MEGA 6.0[13]計算DNA序列之間的Kimura雙參數遺傳距離,再構建鄰接(NJ)聚類樹。

2 結果

通過對獲得的800 bp線粒體D-loop DNA序列在Gen-Bank中BLAST比對，發現所有的序列與日本鰻鱺的D-loop序列相似度最高(＞99%)。34個樣本的D-loop序列分別代表34個不同的單倍型；DNA序列中的多態位點數目(S)為74；單倍型多態性(Hd)為 1.0±0.007；核苷酸多態性(π)為 0.011±0.000 8；單倍型間平均堿基差異數(k)為8.67。

6 個采樣點之間的遺傳差異均很小(FST≤0.023；P＞0.05)[11]。楠溪江與洞頭樣本間的FST指數最大，為0.023，其次為楠溪江與飛云江(FST=0.018)，甌江與飛云江的FST指數為0.006，其余采樣點間幾乎都沒有遺傳差異(表1)。AMOVA分析結果顯示，種群內的分子變異率很高(102%；d.f=5)，而種群間的分子變異率很小(-2.8%；d.f=28)。此外，NJ聚類關系顯示，6個采集點鰻鱺單倍型互相交錯，沒有形成明顯的與地理相關的譜系類群(圖 2)。

圖2 幼鰻D-loop單倍型的NJ聚類樹Fig.2 The NJ tree of D-loop haplotypes of eel larvae

表1 不同采集地點幼鰻樣本的遺傳差異指數(FST)Tab.1 The genetic differentiation index(FST)of eel among different sampling sites

甌江口日本鰻鱺34個樣本的Tajima’s D中性檢驗顯示，D=-1.982 96(P＜0.01)。此外，核苷酸錯配分布曲線呈單峰狀(unimodal distribution)，如圖3所示。

3 討論

傳統上對鰻鱺苗種鑒定的方法主要是依據外形和脊椎骨數量作為分類依據，但形態學方法受到發育階段的限制，因此采用形態學鑒定鰻鱺苗種的方法存在較多缺陷[14]。最近，利用分子手段鑒定鰻鱺苗種的方法受到廣泛關注和認可，線粒體COI[15]，16S rRNA[16]，以及 RAPD[17]等遺傳標記均能有效地鑒別鰻苗的種類，但基于線粒體D-loop序列鑒定鰻苗的研究尚未見諸多報道。之前，已有一些學者報道花鰻鱺D-loop遺傳變異與系統地理關系[7-9]。本研究首次利用分子方法鑒定甌江口6個采樣點的玻璃幼鰻，并通過GenBank Blast發現這些幼鰻的種類為日本鰻鱺。甌江口曾經是國家二級保護動物花鰻鱺的棲息地之一，近年的資源調查中發現該種類已基本絕跡，但仍有日本鰻鱺的蹤跡[18]。本研究與先前研究得出的結論基本一致。

圖3 幼鰻核苷酸錯配分布曲線(預期模型：種群恒定)Fig.3 The nucleotide mismatch distribution curve in the eel larvae(expected null model：constant population size)

單倍型數目、單倍型多態性和核苷酸多態性是基于DNA序列遺傳多樣性研究的幾個重要參數。本研究發現甌江口34尾日本鰻鱺分別為34個不同的單倍型。單倍型多態性(Hd)為1.0，核苷酸多態性(π)為0.011，這說明該甌江口幼鰻地理群體內的遺傳變異水平較高。

各采樣點之間沒有顯著的遺傳差異 (FST≤0.023；P＞0.05)，AMOVA結果顯示種群間的遺傳變異率非常小，這說明甌江口的日本幼鰻未形成地理分化，暗示它們可能隨機地來自于同一個或多個產卵場。

此外，Tajima’s D顯著性的負值(D=-1.982 96，P＜0.01)，表示日本鰻鱺種群在近期歷史上可能曾出現過種群擴張事件。核苷酸錯配分布結果進一步印證了這些日本鰻鱺可能發生過種群爆發性擴張。這一發現與先前的研究報道相吻合[19]，中國東部沿海多數Hd較高、π較低的魚類，在末次冰期以來都有過一次規模較大的種群擴張。