重金屬Zn2+2種暴露方式對三角褐指藻生長繁殖及光系統II的影響

陳 晉，吳常文，張建設，周 超

(浙江海洋大學海洋科學與技術學院，國家海洋設施養殖工程技術研究中心，浙江舟山 316022)

隨著沿海地區經濟的迅速發展和海洋資源的開發利用，海洋污染日益嚴重，其中Cu2+、Zn2+、Cd2+等重金屬離子在海水中的含量不斷上升，重金屬成為海洋的主要污染物。重金屬污染物會對海洋生物造成持續不可逆的傷害，積累到一定限度更會危害到海洋生態系統的結構和功能，或經過食物鏈間接危害到人類健康。海洋微藻作為海洋主要的初級生產者，是海洋食物鏈的基礎和起點。相較于海洋食物鏈中高營養級的生物，海洋微藻對重金屬污染應激反應更為敏感。因此開展重金屬對海洋微藻的毒害作用研究，對于建立相應的污染物監測標準具有重要重要現實意義。

近年來，有關重金屬對海洋微藻毒害作用的研究已初見報道[1-2]。傳統重金屬毒害作用研究，通常集中于重金屬半致死濃度(LC50)或者半抑制濃度(EC50)[3]以及該濃度脅迫下藻類相應的生理生化反應研究[4-5]。由于重金屬在海洋中的濃度是常低于國標濃度，并保持長期低濃度刺激海洋生態系統，因此從低限值持續刺激角度切入，探究重金屬污染對海洋生物的影響，對于完善海洋重金屬污染的毒性脅迫機理具有重要作用。鋅在生物體中起著雙重作用，既是生物代謝必需的微量營養元素，又是一種一定濃度下具高毒性的重金屬。有關鋅對藻類生長的影響已有不少研究[1-4]，而關于重金屬低限值持續刺激下海洋微藻的毒性研究還鮮見報道。硅藻是一類重要的真核浮游生物，其光合產量占據海洋初級生產力的40%[6]，具有重要的生態學地位。三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum Bohlin作為硅藻門中1個重要種類，在水產養殖業中常被用作生物餌料，同時也是一種常用的毒性監測受試生物[3]。本文以硅藻-三角褐指藻為測試目標，探究Zn2+不同脅迫方式對三角褐指藻生長繁殖以及光合作用的影響，旨在掌握不同的刺激方式對海洋浮游植物初級生產力的影響情況。

1 材料與方法

1.1 藻類來源

三角褐指藻藻種購買自上海光語生物科技有限公司。

1.2 培養條件及試劑

培養用的錐形瓶經10%稀HCl浸泡過夜后，用蒸餾水反復沖洗后滅菌備用；培養用海水為自然海水，經自然沉淀后，用0.45 μm微孔濾膜抽濾經充分曝氣消毒后使用。實驗過程中，藻類采用F/2培養基，于GXZ-208B型恒溫光照培養箱培養(寧波江南儀器廠)，其中光照強度為6 000 lx，溫度為20±2℃，光暗周期為 12 h：12 h。

實驗過程中添加的ZnCl2(AR分析純)為國藥生產，配制ZnCl2溶液的水采用超純水。實驗過程中添加的ZnCl2溶液濃度分別為5.000 mg/mL及0.500 mg/mL。鹽酸(HCl，AR分析純)為滬試生產，超純水稀釋到10%備用。

1.3 實驗方法

將10 mL對數生長期的三角褐指藻接種到裝有90 mL新鮮的F/2培養基的250 mL錐形瓶中，起始藻液濃度為8×105cell/mL。實驗組分為2組：一組為強刺激組(high-dosage single exposure，HSE)，另一組為持續弱刺激組(low-dosage repeated exposure，LRE)，HSE組：加入20 μL濃度為5.000 mg/mL的ZnCl2溶液(體積比為0.02%)到培養基，使Zn2+最終濃度為1 mg/L，接近三角褐指藻的半抑制濃度(EC50)[3-4]；LRE組：每日加入20 μL濃度為0.500 mg/mL的ZnCl2溶液(體積比為0.02%)，每天2次持續5 d，5 d后最終使培養基中Zn2+的濃度達到與高濃度組相同的1 mg/L；空白對照組(CK)無ZnCl2添加，所有的試驗都設置3組平行試驗組，在恒溫光照培養箱中培養7 d。在暴露試驗過程中每日搖晃3～4次，防止藻細胞附壁沉降。

1.3.1 三角褐指藻種群增長曲線及生長速率的測定

三角褐指藻種群數量采用血細胞計數板法對三角褐指藻藻細胞進行計數，其中生長速率(μ)采用以下公式[7]計算得到：

式中μ為生長速率，x1和x2分別代表培養時間為t1和t2時藻液的細胞濃度。

1.3.2 葉綠素a含量的測定

葉綠素a含量測定采用熱乙醇法[8]，取2 mL藻液，過GF/F濾膜后，-20℃冷凍過夜后取出迅速放入盛有95%的熱乙醇的離心管，蓋緊后80℃水浴2 min提取葉綠素。提取液經超聲波振蕩10 min，暗處理4 h后，于15 000 r/min、4℃下離心5 min。取上清液于紫外分光光度計(UV-2700，島津)下，測定665 nm及750 nm處的吸光值，經1 mol/L的鹽酸酸化后，再測得665 nm及750 nm處的吸光值。提取液中的葉綠素a濃度根據PORRA[9]的公式計算獲得：

其中：E665和E750為酸化前的吸光值；A665和A750為酸化后的吸光值；27.9為葉綠素a在乙醇相中吸光常數；V乙醇為乙醇相的體積；V樣品為樣品溶液的體積。

1.3.3 快速葉綠素熒光動力學測定

葉綠素熒光參數測量采用浮游植物熒光儀(Phyto-PAM，Walz，德國)測定。每日取2 mL的三角褐指藻樣品經暗適應 5 min后，在最大飽和脈沖光照為 4 000 μmol/(m2·s1)下，測得 F0，Fm，Fv/Fm以及 rETR 的數值。

其中：F0為初始葉綠素熒光產量(minimal fluorescence)；Fm為暗適應后最大熒光產量(maximal fluorescence)；Fv=Fm-F0；Fv/Fm為PSII的光能轉換效率；rETR為相對光合電子傳遞率 (relative electron transport rate)。

1.4 數據處理

實驗結果以平均值±標準誤差(mean±S.E.)表示，差異顯著性設置P＜0.05。鋅脅迫濃度差異采用t檢驗進行統計學處理。實驗數據采用SPSS 18.0.0(Chicago,USA)收集和統計原數據，進行單因素方差分析及Duncan多重比較，α=0.05。

2 結果

2.1 不同暴露方式下重金屬Zn2+對三角褐指藻種群生長狀況的影響

三角褐指藻在重金屬Zn2+不同暴露方式下其種群生長情況如圖1所示。研究表明，對照組的三角褐指藻的生長曲線呈現典型的“S”型生長曲線，而HSE組和LRE組的三角褐指藻種群生長曲線出現明顯的差異(P＜0.05)。相較于對照組，在實驗早期(1～3 d)HSE組三角褐指藻種群生長速率顯著低于對照組和LRE組(P＜0.05)，從第4天開始進入補償生長，生長速率逐漸恢復到對照組水平，第7天觀測結束時仍維持較高的生長速率。LRE組三角褐指藻種群在1～4 d里的生長狀況與對照組相近，第5天增速放緩，在第7天觀測結束時其種群密度顯著的低于HSE組(P＜0.05)。

重金屬Zn2+不同暴露方式下三角褐指藻種群增長速率如圖2所示，LRE組與空白對照組的種群增長趨勢一致，在第3天達到最大增長速率，并隨著時間的變化速率逐漸下降。而HSE組最大增長速率出現在第4天，此后迅速下降；觀測結束時，HSE組三角褐指藻種群增長速率與空白對照組及LRE組相差不大。

圖1 三角褐指藻種群數量隨時間變化圖Fig.1 The population of P.tricornutum changed over time

圖2 三角褐指藻種群增長速率隨時間變化圖Fig.2 The growth ratio of P.tricornutum changed over time

2.2 不同暴露方式下重金屬Zn2+對三角褐指藻葉綠素a含量的影響

三角褐指藻在重金屬Zn2+不同暴露方式下葉綠素a含量隨時間變化情況如圖3所示?？瞻讓φ战M的葉綠素a含量隨時間變化不斷增加；HSE組的三角褐指藻葉綠素a含量隨著時間變化先緩慢下降并顯著低于空白對照組，第6天開始增長至正常水平，與空白對照組含量無顯著差別；LRE組的三角褐指藻葉綠素a含量隨著時間變化不斷下降，第5天開始顯著低于空白對照組。

2.3 不同暴露方式下重金屬Zn2+對三角褐指藻光系統II的影響

重金屬Zn2+不同暴露方式下對三角褐指藻PSII反應中心最大光化學效率(Fv/Fm)變化情況如圖4A所示。在整個暴露實驗過程中，空白對照組的Fv/Fm自第1天到第3天從52.8%增長到71.6%，此后持續的3 d時間內在70%上下波動；而HSE組和LRE組之間并無顯著性差異，第3天開始兩個實驗組的Fv/Fm均要顯著低于對照組(P＜0.05)。從時間變化上來看，HSE組及LRE組并未呈現相關規律，二者在暴露實驗過程中其Fv/Fm均在62%之間上下波動。

重金屬Zn2+不同暴露方式下對三角褐指藻光合作用相對電子傳遞效率(rETR)如圖4B所示。相較于對照組，HSE組在受到大劑量重金屬Zn2+刺激下rETR抑制明顯，并隨著時間逐漸恢復到初期水平，最后第7天HSE組rETR要顯著高于LRE組(P＜0.05)。LRE組在暴露實驗初期rETR值緩慢上升并略高于對照組，但在暴露實驗第4天其rETR較前一天顯著下降并低于低于對照組的值(P＜0.05)，隨著重金屬Zn2+濃度不斷積累其rETR值也隨之不斷下降，并在第7天其rETR值顯著低于對照組及HSE組(P＜0.05)。

圖3 三角褐指藻葉綠素a含量隨時間變化圖Fig.3 The Chlorophyll a of P.tricornutum changed over time

圖4 三角褐指藻光系統II各參數(Fv/Fm、rETR)隨時間變化圖Fig.4 The Chlorophyll fluorescence parameters(Fv/Fm,rETR)of P.tricornutum changed over time

3 討論

3.1 HSE組重金屬Zn2+刺激對三角褐指藻的生物學效應

HSE組所設置的Zn2+濃度為三角褐指藻的EC50[3-4]，高濃度的Zn不僅抑制相對光合電子傳遞效率而且使線粒體膜的功能性降低，葉綠素含量下降，最終影響藻類的生長[10]。在5 mg/L的重金屬Zn2+刺激下，暴露初期(1～3 d)三角褐指藻種群生長受到了顯著抑制，其葉綠素a含量及rERT也受到了不同程度的抑制作用。但在暴露實驗中后期(4～7 d)，HSE組三角褐指藻的種群生長和葉綠素a含量出現了類似“補償效應”的增長，Zn2+對其抑制作用明顯弱化，種群數量及葉綠素a含量恢復到正常水平。該現象與三角褐指藻在N、P限制[11]以及UV脅迫[12]解除時出現的種群生增長狀況相似。推測有可能是微藻的吸附作用[13-14]或者代謝作用[5]降低了高濃度的重金屬Zn2+對三角褐指藻的毒害作用，進而出現補償生長的現象，試驗結果需要進一步驗證。另一方面根據HSE組的rETR雖然在暴露后期有所恢復但是其值仍顯著低于對照組這一現象，推測有可能高濃度的Zn2+已經損傷細胞器，進而影響光合作用。

3.2 LRE組重金屬Zn2+持續刺激對三角褐指藻的生物學效應

LRE組設置的Zn2+濃度為0.5 mg/L為國標[15]設置的水污染1.0 mg/L的一半，在重金屬Zn2+的5 d持續刺激下，在暴露早期(1～3 d)三角褐指藻種群生長與空白對照組無異葉綠素a含量及葉綠素熒光參數也隨之正常增長。這可能是由于Zn是微藻必需的微量元素之一，它對維持生命體的生長、代謝和酶活性等起著非常重要的作用。但隨著封閉的培養液體系中重金屬Zn2+的濃度不斷上升，最終達到HSE組設置的濃度5 mg/L，LRE組三角褐指藻種群提前進入平臺期，其葉綠素a含量及葉綠素熒光參數在第4天前后開始下降。這與PAULSSON，et al[16]在G?ta ?lv流域研究藻類重金屬鋅的長期積累性毒害作用，亦發現類似結果。研究發現，7 d時LRE組rETR值遠低于對照組以及HSE組。研究表明，低濃度Zn2+污染(低于國標水污染濃度)在海水中對三角褐指藻亦具有積累性毒害作用。

4 結論

本文比較了HSE和LRE兩種暴露方式下重金屬Zn2+對三角褐指藻的生態毒性效應，結果表明HSE的脅迫方式在暴露起始階段對三角褐指藻的毒性表現最為明顯，并具有時效性；而LRE的脅迫方式在整個暴露實驗中在葉綠素a含量和PSII電子傳遞方面表現出顯著的積累性變化。研究發現，長期低濃度的重金屬Zn2+在水體中能造成三角褐指藻持續的毒害作用甚至造成細胞損傷，進而影響光合作用。