微波輔助紫荊籽中蛋白質的提取工藝研究

董翠芳，孫栗緣

(滄州師范學院 化學與化工學院，河北 滄州 061001)

植物籽粕作為植物制油過程中的副產物，含有多種具有較高利用價值的成分，如碳水化合物、纖維素、粗脂肪以及礦物質等[1]，其中蛋白質是含量較高的重要成分[2].與動物蛋白相比，植物蛋白日常用量較大，提取原料具有普遍性，且在加工生產中，成本低廉、工藝相對簡單[3].紫荊是豆科紫荊屬植物[4]，其莢果產量豐富，常被丟棄，十分可惜.開發和利用紫荊籽中的植物蛋白，對實現紫荊籽的廢棄物再利用具有一定的意義.

目前，提取植物蛋白質較成熟的方法有：水相酶解法、有機溶劑法、超聲波輔助技術、水相萃取法等.其中水相萃取法由于其工藝簡單、成本低，易于工業化生產，相比較于有機溶劑法，對環境污染程度低等優點而常被使用[5].常用的水相有：NaOH溶液、水、稀酸、NaCl溶液及六偏磷酸鈉溶液等.本研究以滄州師范學院校園景觀樹紫荊的籽為原材料，用石油醚浸提去除紫荊籽中的油脂得紫荊籽粕，采取微波輔助-水相萃取法進行紫荊籽蛋白的提取，利用單因素實驗和正交實驗對紫荊籽蛋白的提取工藝進行優化進而得到最佳提取工藝條件.同時討論微波輔助提取技術在紫荊籽蛋白提取方面的優勢及可行性，為紫荊籽蛋白的開發利用提供理論依據和實踐指導.

1　實驗部分

1.1　儀器與藥品

儀器：XO-SM200超聲波微波組合反應系統(南京先歐儀器制造有限公司)、金怡TDL-5低速臺式大容量離心機(江蘇省金壇醫療儀器廠)、721-分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)、SL-100型高速多功能粉碎機(浙江省永康市松青五金廠)、202-2型干燥箱(上海市實驗儀器總廠).

原料預處理：紫荊籽(采自滄州師范學院)烘干粉碎，經石油醚脫脂后干燥粉碎過60目篩得紫荊籽粕.

藥品：牛血清白蛋白(生化試劑)、考馬斯亮藍(G-250)、石油醚(沸程60-90℃)、95%乙醇、85%磷酸、氫氧化鈉、36%-38%濃鹽酸、氯化鈉、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、硼酸、甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑等(均為分析純).

1.2　實驗方法

1.2.1微波輔助水相萃取紫荊籽蛋白

稱取一定質量的紫荊籽粕，按比例加入萃取劑置于微波輔助萃取儀中，設置一定的微波功率、提取時間和提取溫度萃取紫荊籽蛋白；將液料轉入離心管內，在轉速3000r/min下離心15min，得到紫荊籽蛋白提取液.

1.2.2提取液中蛋白質含量的測定

采用考馬斯亮藍法[6]測定上清液中的蛋白質含量，計算紫荊籽蛋白提取率.

配制考馬斯亮藍G-250溶液：稱取考馬斯亮藍G-250晶體100mg，加入95%的乙醇50mL，再加入85%的磷酸100mL，充分溶解，轉移至1000mL容量瓶中，用蒸餾水定容，過濾置于棕色試劑瓶中，保存于4℃冰箱中備用.

配制標準蛋白溶液：稱取標準結晶牛血清白蛋白晶體100mg，用蒸餾水定容至1000mL，混合均勻，配成質量濃度為0.10mg·mL-1的標準蛋白質溶液，保存于4℃冰箱中備用.

繪制標準曲線：吸取標準蛋白溶液0，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00mL于10mL容量瓶中，分別加入3.00mL考馬斯亮藍溶液，加水定容至10mL，搖勻.以第一份為空白對照于595nm波長處測定吸光度.繪制標準曲線，得標準曲線的回歸方程為Y=45.043X+0.0003，r=0.9961.其中Y為吸光度，X為牛血清白蛋白的濃度(mg·mL-1).

測定蛋白質含量：吸取1.00mL紫荊籽蛋白提取液，按上述步驟操作測定其吸光度，以標準曲線回歸方程計算蛋白質質量.

紫荊籽粕中粗蛋白總質量=紫荊籽粕質量×23.5%(按照國家標準GB/T5511-2008進行測定).

2　結果與討論

2.1　提取溶劑的選擇

分別選擇蒸餾水、稀堿(NaOH，0.1mol·L-1)、稀酸(HCl，0.1mol·L-1)、3.2%NaCl溶液作為提取溶劑進行實驗，考察不同提取溶劑對紫荊籽蛋白質提取率的影響[7].采用微波輔助萃取，在微波功率100W、提取時間30min、液料比40∶1、提取溫度35℃等相同的條件下進行提取.以紫荊籽蛋白提取率為標準，確定采用NaOH溶液為提取溶劑.實驗結果如表1.

表1　不同提取溶劑對紫荊籽蛋白提取率的影響

2.2　單因素實驗

2.2.1NaOH濃度對紫荊籽蛋白質提取率的影響

圖1　NaOH濃度對蛋白質提取的影響

選取NaOH濃度(質量分數)分別為0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%，其他參數條件分別固定為：微波功率100W，提取時間30min，液料比40∶1，提取溫度35℃，進行紫荊籽蛋白質的提取實驗，結果見圖1.

由圖1可知，NaOH濃度對紫荊籽蛋白質提取率有顯著的影響，呈現先上升后下降的趨勢.當NaOH濃度達到1.5%時蛋白質提取率最大，繼續增大堿濃度，會使部分蛋白質發生堿水解而降低提取率[8].因此，選取NaOH濃度為1.5%時最佳.

2.2.2微波功率對紫荊籽蛋白質提取率的影響

選取微波功率分別為80W、90W、100W、110W、120W，其他參數條件分別固定為：NaOH濃度1.5%，提取時間30min，液料比40∶1，提取溫度35℃，進行紫荊籽蛋白質的提取實驗，結果見圖2.

由圖2可知，隨著微波功率的增大，蛋白質的提取效果增強，當功率達到100W時蛋白質提取率最高.當微波功率過高時，微波局部溫度瞬時升高，導致部分蛋白質變性進而提取率下降[9].所以，以微波功率100W為最佳功率.

2.2.3提取時間對紫荊籽蛋白質提取率的影響

選擇提取時間分別為10min、20min、30min、40min、50min，其他參數條件分別固定為：NaOH濃度1.5%，微波功率100W，液料比40∶1，提取溫度35℃，進行紫荊籽蛋白質的提取實驗，結果見圖3.

由圖3可知，提取時間小于30min時，由于提取時間過短，大量蛋白質沒有溶解，故而蛋白提取率偏低.隨著提取時間的延長，提取率不斷增大.超過30min后由于微波熱效應引起的熱變性導致蛋白質溶解性質發生改變，從而導致提取率下降[10]，最終確定提取時間為30min.

圖2　微波功率對蛋白質提取率的影響

圖3　提取時間對蛋白質提取率的影響

2.2.4液料比對紫荊籽蛋白質提取率的影響

取液料比分別為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1，其他參數條件分別固定為：NaOH濃度1.5%，微波功率100W，提取時間30min，提取溫度35℃，進行紫荊籽蛋白質的提取實驗，結果見圖4.

由圖4可知，在液料比為50∶1之前，由于液料比太小，蛋白質只能部分溶解，導致提取率偏低，但隨著液料比的增加提取率有升高趨勢，說明增加液料比有助于蛋白質的提取.當液料比增加到一定程度，紫荊籽蛋白基本全部溶解，再繼續增加液料比沒有意義[11]，因此確定液料比為50∶1.

2.2.5提取溫度對紫荊籽蛋白質提取率的影響

選取提取溫度分別為25℃、35℃、45℃、55℃、65℃，其他參數條件分別固定為：NaOH濃度1.5%，微波功率100W，提取時間30min，液料比50∶1，進行紫荊籽蛋白質的提取實驗，結果見圖5.

圖4　液料比對蛋白質提取率的影響

圖5　提取溫度對蛋白質提取率的影響

由圖5得知，在25-45℃的區間內，提取率隨著溫度的上升而增加，其原因可能是溫度升高，分子劇烈運動，易析出蛋白.在45℃時，蛋白質全部溶解，提取率最高.超過45℃后，提取率呈平緩下降趨勢.這可能是由于溫度過高易使蛋白質聚集，降低溶解度，導致提取率下降[12].所以選取45℃為蛋白質提取的最適溫度.

2.3　正交實驗

選取NaOH濃度、微波功率、提取時間和提取溫度四個因素，結合單因素實驗的結果，設計四因素三水平(L934)的正交實驗，以紫荊籽蛋白的提取率為標準，研究四個因素對提取率影響的主次關系，并對提取的工藝條件進行優化.具體的正交實驗方案見表2，實驗結果見表3.

表2　因素水平表

表3　正交實驗方案與結果分析

對表3的正交實驗結果進行直觀分析[13]，由極差大小可知，影響紫荊籽蛋白提取率的各個因素的主次關系為：B>C>A>D.各因素的優選組合為A3B2C2D2，即優化后的最佳工藝條件為：NaOH濃度2.5%，微波功率100W，提取時間30min，提取溫度45℃.

2.4　驗證實驗

在最佳工藝條件下進行3次平行實驗，實驗得蛋白質的平均提取率為90.4%.結果如表4，優化條件具有穩定性和實際可操作性[14].

表4　驗證實驗結果

2.5　提取方法的比較

分別采用微波輔助-水相萃取法和單獨水相萃取法，在NaOH濃度2.5%，提取時間30min，液料比50∶1，提取溫度45℃等相同的條件下進行蛋白質提取實驗.實驗結果如表5.

表5　不同提取方法對紫荊籽蛋白提取率的影響

由表5可知，微波輔助-水相萃取法對紫荊籽蛋白的提取效果好，提取率高，這可能是由于微波的破壁效應和熱效應，使得籽粕蛋白能夠更好的溶出[15].

3　結論

以脫脂紫荊籽粕為原材料，通過單因素實驗和正交實驗優化了微波輔助-水相萃取法提取紫荊籽蛋白的最佳工藝條件，即NaOH濃度2.5%，微波功率100W，提取時間30min，液料比50∶1，提取溫度45℃.在此條件下紫荊籽蛋白的提取率為90.4%.其中微波功率對提取率的影響最大，提取時間和NaOH濃度次之，提取溫度的影響最小.實驗結果表明，將微波輔助技術應用于紫荊籽蛋白的提取，具有快速高效、條件溫和、提取率高等特點.

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