一例耐藥嚴重的大腸桿菌和輪狀病毒混合感染案例

殷鑫歡，楊曉宇，徐 雷，王佳煜，李原野，徐志文，2，朱 玲，2

（1.四川農業大學動物醫學院，四川 成都 611130；2.四川農業大學動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 611130）

豬輪狀病毒（Porcine rotavirus,PoRV）、豬傳染性胃腸炎病毒（Porcine transmissible gastroenteritis,TGEV）、豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea,PEDV）是引起仔豬腹瀉的主要3種病毒。其中豬輪狀病毒屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae）輪狀病毒屬（Rota-virus），豬的輪狀病毒多發于每年的12月至翌年的1、2月份，夏季也有該病暴發的報道。并且各種年齡、性別的豬都可以感染輪狀病毒，尤其以仔豬感染最為嚴重，1周齡以內的仔豬在無母源抗體的保護下感染，隨著年齡的增長，豬感染輪狀病毒的癥狀有所減輕。研究報道，豬輪狀病毒常和大腸桿菌、沙門氏菌等混合感染，且與豬流行性腹瀉病毒混合感染引起的腸道損傷比單一感染造成的損傷更為嚴重。PoRV存在多種血清型，各血清型之間無交叉保護或交叉保護性很差。資料顯示，我國豬群中輪狀病毒的感染以A群為主，在A群中VP7是中和抗原基因，它編碼輪狀病毒外殼上主要糖蛋白和中和抗原蛋白，在各毒株中高度保守。

豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的豬的一種急性傳染病，主要表現為腸炎、腸敗毒血癥等多種臨床癥狀，世界各地均有發生，造成新生仔豬大批死亡或生長不良。豬大腸桿菌由于豬的生長期和引起發病的血清型的差異，可將疾病分為仔豬黃痢、仔豬白痢和仔豬水腫。傳播途徑主要是母豬糞便中排出的致病性大腸桿菌，污染母豬的皮膚與周圍環境，仔豬通過吃乳和舔吮母豬的皮膚而感染。但是疾病的發生與周圍環境、衛生條件以及哺乳母豬的體質存在著密切的關系。由于畜牧獸醫上常使用抗生素作為促生長劑以提高生產效益，并且我國在獸用藥物的生產管理上還不規范，抗生素的使用很不規范，很多頭孢三四代藥物直接就使用，而沒有使用有效果的頭孢一二代，一些平時比較簡單的臨床癥狀直接就使用抗生素，導致發病時抗生素的使用效果較差。

1 發病情況、臨床癥狀和剖解癥狀

2017年，四川省綿陽市某豬場的產房小豬普遍發生黃色水樣腹瀉，外觀表現為小豬被毛凌亂，耳部發紺，消瘦，通過解剖發現肺臟、肝臟沒有什么特殊癥狀，主要就是腸道積滿了黃色的水樣物，結合臨床癥狀，診斷為PoRV和大腸桿菌混合感染。通過對從肝臟和小腸腹瀉物中分離的大腸桿菌進行實驗室的藥敏試驗發現，該大腸桿菌耐藥嚴重，20多種檢測的藥物之中，百分之九十都耐藥，耐藥情況比較嚴重。

2 實驗室檢測

2.1 試驗地點

病料（2頭腹瀉仔豬，分別用編號1和2來代替）送至四川農業大學動物生物技術中心進行檢測。

2.2 試驗試劑

DNA、RNA提取試劑盒，Taq DNA聚合酶，RNA反轉錄試劑盒，均購自TaKaRa公司，引物均由上海Sangon生物工程公司合成。

2.3 試驗器材

美國Thermo Micro21R微量離心機購自賽默飛成都分公司；PCR儀購自成都伯樂科技有限公司。

2.4 檢測方法

（1）取樣小腸腹瀉段研磨提取病料中的RNA和DNA，采用反轉錄-聚合酶鏈式反應RT-PCR檢測 PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV（豬德爾塔冠狀病毒），聚合酶鏈式反應PCR方法檢測PRV（豬偽狂犬病病毒）、PCV2（圓環病毒2型）。試驗方法均按照試劑盒說明書操作，所用引物如下。

根據GenBank已發表的上述病毒的序列，采用本實驗室的檢測通用引物，均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）進行RT-PCR和PCR檢測。

表1 PCR引物序列

（2）采取病豬的肝臟和小腸黃色腹瀉物分別劃線麥康凱培養基，置于細菌培養箱37℃培養，12 h后均長出了紅色的菌落，即為大腸桿菌，染色觀察為單個存在的革蘭氏陰性桿菌，挑取單個菌落接種LB肉湯置于細菌搖床37℃、180 r/min培養12 h。0.2 mL/只腹腔注射小白鼠，結果小鼠同樣表現出腹瀉，黏附墊料并且于24 h內死亡，解剖之后肝臟同樣能夠分離到大腸桿菌。

3 結果與防治措施

（1）通過對幾種能夠引起腹瀉的病毒檢測，這次病例中只有PoRV檢測為陽性，條帶大小為308 bp，圖1中檢測的兩頭豬中1號為PoRV陽性，2號沒有檢測出PoRV，圖1中分別設置陰陽性對照，證明本試驗是成立的。

圖1 兩份病豬樣品PoRV電泳結果

（2）大腸桿菌的藥敏結果見表2，參照標準為藥品試驗紙片抑制法，由杭州天河微生物試劑有限公司采用美國NCCLS最新藥敏試驗法規制備的標準厚紙片，紙片直徑（6.0±0.05）mm，紙片含藥量符合標準。

表2 大腸桿菌藥敏結果

（3）針對檢測結果，采取防治措施：①免疫接種。對仔豬使用豬傳染性胃腸炎、輪狀病毒弱毒疫苗（哈爾濱獸醫研究所研制）進行免疫預防，新生仔豬可在吮乳前肌注傳染性胃腸炎、輪狀病毒二聯弱毒疫苗1 mL，至少經過30 min才能再吮乳，并在斷奶前7～10 d肌內注射2 mL，才能夠持續保護6個月，妊娠母豬可分別在分娩前5～6周和1周肌內注射1 mL。②要加強飼養管理，豬場嚴格采取全進全出制，從確保沒有感染疾病的地方引進豬群，豬圈要經常清掃，且飼養不同批次的豬圈必須經過全面徹底的消毒處理。③豬場應該合理使用抗生素，并且避免直接使用規格較高的像頭孢三四代藥物，也不能頻繁使用抗生素，至于在飼料里面添加的預防類的抗生素可以隔一段時間換一下，避免菌株產生耐藥性以致于后面使用抗生素沒有什么作用，像這次分離的大腸桿菌就是耐藥性特別嚴重，上述的藥物對它都沒有什么效果或者完全耐藥，因此在臨床中一定要合理使用抗生素。此外，仔豬在斷奶階段可以服用一些微生態制劑調節仔豬腸道菌群平衡，以抑制致病性大腸桿菌的增殖。

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